[发明专利]基因联合转染BMSCs的组织工程骨构建及其应用

摘要

本发明公开了基因联合转染BMSCs的组织工程骨构建及其应用，通过分别构建携带人bFGF和BMP‑2、GFP基因的重组慢病毒载体，基因转染BMSCs，建立起人bFGF/BMP2基因联合转染可增强BMSCs的成骨功能，探明bFGF/BMP2调控OPN和Collagen‑Ⅰ等成骨非特异性基因表达机制，通过将基因转染的BMSCs复合异种骨支架材料构建GFP标记的组织工程骨，回植颌骨缺损动物模型；克服单独基因转染带来的不足，获得解决“组织工程骨组织构建及其在颌骨缺损修复中的难题‑成血管及成骨功能，在口腔修复、骨移植治疗提供具有广阔应用前景的植骨材料，具有现实的价值和意义。

主权项

一种基因转染 BMSCs 的组织工程骨，其特征在于，组织工程骨通过以下技术步骤获得构建：(1) 构建人 bFGF、BMP2、GFP重组慢病毒载体：分别构建携带人bFGF、BMP2、GFP基因重组慢病毒载体，建立基因转染技术，构建人bFGF、BMP2、GFP‑plenti6/V5‑D‑TOPO vector 表达质粒，经基因测序证实无移码突变；在 Lipofectamine 2000 脂质体介导下，分别与三种包装质粒，共转染293T细胞，获得 bFGF‑重组慢病毒株，BMP2‑重组慢病毒株，GFP‑慢病毒病毒株；将三种病毒株感染羊骨髓间充质干细胞，用blasticidin筛选，得到稳定表达的 bFGF、BMP2和GFP基因的细胞株，经Western‑blot和倒置荧光显微镜检测bFGF、BMP2 和GFP蛋白表达；通过实时定量PCR和ALP检测，bFGF/BMP2基因联合转染组BMSCs，非特异性成骨基因表达量较高，具备较好的成骨及成血管能力；研究结果证实人bFGF/BMP2 基因联合转染可增强BMSCs的成骨功能，初步探明 bFGF/BMP2 调控OPN和Collagen‑Ⅰ成骨非特异性基因表达机制；(2)人bFGF和BMP‑2基因转染BMSCs，GFP基因转染BMSCs：将人bFGF、BMP2、GFP 基因重组慢病毒株，添加到成骨方向诱导的BMSCs 培养基中，通过抽取羊骨髓，进行骨髓间充质干细胞原代培养并行成骨诱导，RT‑PCR 检测 BMSCs非特异性成骨基因 mRNA 水平表达，BMSCs 向成骨诱导分化过程中，骨桥蛋白、骨钙素和Ⅰ型胶原在 mRNA 水平阶段性表达，BMSCs成功向成骨细胞分化；经Blasticidin 抗生素筛选，得到稳定表达目的基因的 BMSCs；(3) 制备异种骨支架材料：选用成年羊脊椎骨，去除表面骨皮质后切成 0.5cm×0.5cm×0.5cm 的立方体，采用体积分数 30％ H2O2浸泡 12h 脱蛋白；经甲醇/氯仿按照体积比1∶1浸泡12h 脱脂，处理重复3次，超声震荡仪清洗；干燥后，浸泡在0.09mol/L 焦磷酸钠[Na4P2O7.10H2O] 溶液中，70℃恒温水浴锅温浴12h，取出骨块干燥，经高温煅烧工艺，在煅烧温度达到 1000℃时维持 3h 煅烧后，采用碾磨的方法制备成骨粉，60Co 消毒、封装制备出羊椎骨煅烧陶瓷骨粉，制备的羊椎骨煅烧陶瓷骨粉主要矿物晶相为羟基磷灰石和β‑磷酸三钙；采用经过高温微波煅烧工艺制备获得羊椎骨煅烧陶瓷骨粉作为异种骨支架材料，具有良好的孔隙率、低免疫原性的异种骨支架材料，包括羟基磷灰石和β‑磷酸三钙构成，该支架适宜作为 BMSCs 附着、生长、增殖、代谢的微环境；(4) 构建GFP标记的组织工程骨：将上述步骤(2)基因转染的 BMSCs消化，计数，制备细胞悬液，将异种骨支架材料用培养基润湿，将细胞悬液接种到异种骨支架材料上，细胞培养箱中孵育 24 小时，即制得 GFP 标记的组织工程骨；将基因转染的 BMSCs，细胞浓度为1×106/mL，与异种生物骨支架材料支架共培养24小时后，成功构建GFP标记的组织工程骨。