[发明专利]一种利用蓝莓莱格西叶片诱导产生微不定芽的繁育方法

摘要

本发明公开了一种利用蓝莓莱格西叶片诱导产生微不定芽的繁育方法，步骤包括(1)无菌试管苗培育；(2)叶片愈伤组织培养；(3)叶片微不定芽分化；(4)微不定芽成苗(5)试管苗生根；(6)试管苗移栽；本发明通过无菌试管苗的培育和利用无菌试管苗叶片产生微不定芽，将带有微不定芽愈伤块转接到成苗培养基中获得大量成苗植株，解决了利用蓝莓莱格西叶片产生微不定芽及微不定芽难成苗的技术问题。利用本发明技术方法可在较短时间内提供大量优质组培苗，达到快速工厂化育苗的标准，可满足国内对蓝莓莱格西优质种苗的需求。

主权项

一种利用蓝莓莱格西叶片诱导产生微不定芽的繁育方法，步骤包括：(1)无菌试管苗培育；(2)叶片愈伤组织培养；(3)叶片微不定芽分化；(4)微不定芽成苗；(5)试管苗生根；(6)试管苗移栽；其中：步骤(1)所述无菌试管苗培育的方法是：选取当年生幼嫩枝条顶梢长10±1cm，去掉叶片，剪成带2个芽茎段，消毒后接种到茎段侧芽启动培养基中，置于组培室，白天光照强度为2000～2500Lux，光照时间12～14h·d‑1，温度25±1℃；夜间温度18±1℃，20～25d后侧芽萌发，获得无菌苗；茎段侧芽启动培养基是指：WPM培养基+6‑BA 0.3～0.5mg·L‑1+蔗糖20～25g·L‑1+琼脂4～5g·L‑1，pH值5.4～5.6；步骤(2)所述叶片愈伤组织培养的方法是：将步骤(1)培育的无菌苗叶片切去叶缘，沿叶脉横着划伤2刀，接种于培养叶片愈伤组织培养基中，置于培养箱中暗培，温度25±1℃，15～20d后获得叶片淡黄色愈伤组织；步骤(3)所述叶片微不定芽分化的方法是：将步骤(2)培养的叶片淡黄色愈伤组织切成0.2～0.5cm3块状，转接种到叶片微不定芽分化培养基中，以步骤(1)昼夜光照周期条件培养10～15d获得带有微不定芽愈伤块；步骤(4)所述微不定芽成苗的方法是：将步骤(3)培养的带有微不定芽愈伤块转接到微不定芽成苗培养基中，以步骤(1)昼夜光照周期条件培养15～20d获得3～5cm成苗植株；步骤(5)所述试管苗生根的方法是：将步骤(4)获得的成苗，将其从基部切下，接种到生根培养基中，以步骤(1)昼夜光照周期条件培养12～15d获得生根数5～6条、根长1～2cm的生根植株；生根培养基是指：1/2WPM培养基+0.2～0.5mg·L‑1吲哚丁酸(IBA)+0.01～0.03mg·L‑1萘乙酸(NAA)+0.1～0.2mg/L玉米素(ZT)+20～25g·L‑1蔗糖+4～5g·L‑1琼脂，pH值5.4～5.6；1/2WPM培养基是指WPM培养基组分中大量元素减半且其余为WPM全量元素，其具体组分为：NH4NO3 400mg·L‑1，Ca(NO3)2·4H2O 556mg·L‑1，K2SO4 990mg·L‑1，CaCl2·2H2O 96mg·L‑1，KH2PO4 170mg·L‑1，Na2MoO4·2H2O 0.25mg·L‑1，MgSO4·7H2O 370mg·L‑1，MnSO4·4H2O 22.4mg·L‑1，ZnSO4·7H2O 8.6mg·L‑1，CuSO4·5H2O 0.25mg·L‑1，FeSO4·7H2O 27.8mg·L‑1，Na2‑EDTA37.3mg·L‑1，盐酸硫胺素1.0mg·L‑1，烟酸0.5mg·L‑1，盐酸比哆醇0.5mg·L‑1，肌醇100mg·L‑1，甘氨酸2.0mg·L‑1；步骤(6)所述试管苗移栽的方法是：把步骤(5)获得的生根植株移到温室中适应2～3d后，用镊子将苗轻轻夹出，放到盛有清水的容器中，用清水洗去根部残留的培养基，移栽到装有育苗基质的营养杯中，放置于遮光度70％～80％遮荫网温室内，利用自动间歇喷雾装置保持室内空气相对湿度在85％以上，炼苗12～15d后，温室内逐渐通风，再继续培养12～15d，移栽的试管苗成活率90％以上；其中所述育苗基质的成分以体积比计为：蛭石:珍珠岩:草炭土＝2:3:5，且营养杯中育苗基质上面放置有1.5～2cm厚的处理过的苔藓；其特征在于：叶片愈伤组织培养基是指：MSB培养基+苯基噻二唑基脲(TDZ)0.5～2.0mg·L‑1+玉米素(ZT)3.5～4.5mg·L‑1+萘乙酸(NAA)0.5～1.0mg·L‑1+25～35mg·L‑1蔗糖+4～5mg·L‑1琼脂，pH值5.2～5.4；叶片微不定芽分化培养基是指：MSB培养基+苯基噻二唑基脲(TDZ)0.1～1.0mg·L‑1+玉米素(ZT)3.0～5.0mg·L‑1+吲哚丁酸(IBA)0.3～0.5mg·L‑1+25～35mg·L‑1蔗糖+4～5mg·L‑1琼脂，pH值5.2～5.4；微不定芽成苗培养基是指：WPM培养基+玉米素(ZT)3.0～5.0mg·L‑1+吲哚丁酸(IBA)0.2～0.4mg·L‑1+25～35mg·L‑1蔗糖+4～5mg·L‑1琼脂，pH值5.2～5.4；其中MSB培养基的组分为：KNO3 1900mg·L‑1，NH4NO3 1650mg·L‑1，MgSO4·7H2O 370mg·L‑1，KH2PO4 170mg·L‑1，CaCl2·2H2O 440mg·L‑1，MnSO4·4H2O 22.3mg·L‑1，ZnSO4·7H2O 8.6mg·L‑1，H3BO3 6.2mg·L‑1，KI 0.83mg·L‑1，NaMoO4·2H2O 0.25mg·L‑1，CuSO4·5H2O 0.025mg·L‑1，CoCl2·6H2O 0.025mg·L‑1，Na2‑EDTA 37.3mg·L‑1，FeSO4·7H2O 27.8mg·L‑1，盐酸硫胺素10mg·L‑1，盐酸比哆醇1.0mg·L‑1，烟酸1.0mg·L‑1，肌醇100mg·L‑1；WPM培养基的组分为：NH4NO3 400mg·L‑1，Ca(NO3)2·4H2O 556mg·L‑1，K2SO4 990mg·L‑1，CaCl2·2H2O 96mg·L‑1，KH2PO4 170mg·L‑1，Na2MoO4·2H2O 0.25mg·L‑1，MgSO4·7H2O 370mg·L‑1，MnSO4·4H2O 22.4mg·L‑1，ZnSO4·7H2O 8.6mg·L‑1，CuSO4·5H2O 0.25mg·L‑1，FeSO4·7H2O 27.8mg·L‑1，Na2‑EDTA 37.3mg·L‑1，盐酸硫胺素1.0mg·L‑1，烟酸0.5mg·L‑1，盐酸比哆醇0.5mg·L‑1，肌醇100mg·L‑1，甘氨酸2.0mg·L‑1。