[发明专利]一种水产品孔雀石绿的磁性分子印迹仿生ELISA检测方法

摘要

本发明公开了一种水产品孔雀石绿的磁性分子印迹仿生ELISA检测方法，它包括磁性分子印迹聚合物的制备和直接竞争ELISA方法的建立等实验步骤，本发明首先用乳液聚合法制备了粒径均匀的孔雀石绿磁性分子印迹聚合物（MG‑MMIPs），并考察其吸附性能，将此MG‑MMIPs作为仿生抗体，利用它对MG抗原和酶标记MG抗原的竞争性吸附，建立直接竞争的ELISA检测方法。该方法在最适反应条件下建立的标准曲线灵敏度为20.14μg L‑1，最低检出限为0.12μg L‑1，低于孔雀石绿快速检测卡的检出限2 ppb(ng/g)；同时，该方法对MG具有很高的选择性，对MG的两种结构类似物（甲基紫和亮绿）的交叉反应率分别为7.4%和3.9%。

主权项

一种水产品孔雀石绿的磁性分子印迹仿生ELISA检测方法，其特征在于，具体步骤如下：(1)Fe3O4的合成：称取0.30～0.36g聚乙二醇，加入7～9mL超纯水，超声直至聚乙二醇完全溶解，称取2.00～2.06g FeCl3加入到聚乙二醇溶液中超声溶解，再称取1.4～1.6g FeCl2加入到上述溶液中至完全溶解，立即加入0.4～0.6mL 0.1mol L‑1稀盐酸，通氮除氧12～18min，60℃水浴下边搅拌边迅速加入55～65mL氨水，调转速至1500r min‑1，反应1h，用磁铁进行吸附，并用超纯水洗脱4～6次，真空冷冻干燥后保存备用；(2)预聚合溶液的配制：将0.08～0.12g Fe3O4加入0.8～1.2mL油酸中并用玻璃棒搅拌均匀，加入8～12mL 0.05mol L‑1MG氯仿溶液和43～170μL功能单体，在400r min‑1的转速下搅拌25～35min，4℃下静置1.5～2.5h形成A液；(3)预乳化溶液的配制：将Span‑80和tween‑80各0.4～0.6mL加入22～28mL超纯水中，再加入475～950μL交联剂，在400r min‑1下搅拌25～35min形成B液；(4)MG磁性分子印迹聚合物的制备：在400r min‑1转速搅拌下，将A液缓慢加入到B液中，氮气除氧18～22min，将温度升到60℃，加入0.08～1.2g偶氮二异丁腈引发聚合16～20h，反应结束后用22～28mL甲醇破乳，抽滤后得到粗孔雀石绿磁性分子印迹聚合物，产物用体积比为8～10:1的甲醇‑乙酸混合液索氏提取至无孔雀石绿模板洗出，再用甲醇洗至中性，最后用超纯水洗去甲醇，真空冷冻干燥后备用；(5)半抗原的合成：将850～950mg 4‑甲酰基苯甲酸、2.2～2.6mL N,N‑二甲基苯胺和2.2～2.6g无水ZnCl2溶解在60mL无水乙醇中，氮气保护下加热回流22～26h，室温冷却后，加入28～32mL甲醇，滴加氨水至沉淀产生，过滤后用水冲洗，真空中用KOH进行干燥得到羧基化的隐性孔雀石绿；三氯甲烷溶解羧基化的隐性孔雀石绿，加入四氯对苯醌、冰醋酸25℃下搅拌反应1～2h，反应产物经等体积的三氯甲烷‑四氯甲烷洗涤2～3次，真空干燥可获得半抗原羧基化孔雀石绿粉末；(6)酶标抗原的合成：将1.8～2.2mg半抗原羧基化孔雀石绿CMG粉末溶于0.8～1.2mL 20％N,N‑二甲基甲酰胺溶液，边磁力搅拌边加入1.8～2.2mg mL‑1EDC 32～24μL，调pH 4.5～5.0，反应18～22min后，迅速加入7.0～8.0mg辣根过氧化物酶HRP，调pH至7.8～7.2，室温反应2.5～3.5h得到CMG‑HRP偶联物，20℃冷冻保存；(7)检测：取18～22mg磁性分子印迹聚合物置于10mL离心管中，加入浓度为0.1～10000μgL‑1的MG‑PBS缓冲溶液2.8～3.2mL，然后立即加入稀释度为1：1400～1600的酶标抗原溶液2.8～3.2mL，不加MG溶液的离心管为对照组，冰浴振荡吸附1.5～2.5h；弃上层溶液，每管加入140～160μL底物显色液，显色25～35min后每管加入45～55μL终止液，立即在酶标仪上读数，计算各个浓度下MG对抗原抗体结合反应的抑制率。