[发明专利]hTERT慢病毒重组体永生化人牙周膜干细胞系的方法

摘要

hTERT慢病毒重组体永生化人牙周膜干细胞系的方法，包括以下步骤：步骤一、原代人牙周膜干细胞(hPDLSC)的培养：步骤二、稳定表达hTERT基因的永生化基因工程细胞系hTERT‑PDLSC构建：本发明利用表达hTERT基因的慢病毒载体，在一定条件下将其感染原代培养的PDLSC，经过嘌呤霉素的抗性筛选，得到稳定表达hTERT基因的永生化细胞系，能够将细胞使用寿命从3‑8代延长至35代，得到性质稳定、功能良好、表型正常的永生化细胞模型；本发明在研究牙周膜干细胞对于牙周组织工程、研发有效的治疗牙周炎的药物方面具有有益效果。

主权项

hTERT慢病毒重组体永生化人牙周膜干细胞系的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一、原代人牙周膜干细胞(hPDLSC)的培养：收集拔除的前磨牙，刮取牙根中1/3牙周膜组织，800rpm离心5min后，沉淀中并按照1个牙取得的组织都加1mLⅠ型胶原酶吹打混匀，置于37℃， 5％CO₂， 饱和湿度的标准环境细胞培养箱消化至组织松散，每隔3‑5d更换正常培养液一次，正常培养液成分为：体积比79％的DMEM/F12培养基中加入体积比为20％的胎牛血清，体积比为1％的三抗混匀，待有细胞克隆出现，用滤纸片挑取细胞克隆扩大培养，扩大培养的方式是消毒干燥的滤纸片沾湿0.2％胰酶后于克隆位置消化5‑10秒，利用滤纸片将消化下的细胞转移至新的培养皿中继续培养，得到的第3代生长状态佳的人牙周膜干细胞hPDLSC为长梭形、呈放射状生长；步骤二、稳定表达hTERT基因的永生化基因工程细胞系hTERT‑PDLSC构建：取步骤一培养得到的第3代生长状态佳的hPDLSC消化后接种于24孔板，每孔500μL；24h后待细胞贴壁生长，然后再在每孔中加增强感染效率的试剂Enhanced infection solution ENi.S.原液243.25μL、10mg/mL聚凝胺polybrene 0.25μL，以及按照MOI＝65加入携带hTERT基因1*10⁵TU/μL的慢病毒原液6.5μL，混合均匀混合均匀；24h后换正常培养液，2d后再换含有2μg/mL嘌呤霉素的培养基，隔2d用含2μg/mL嘌呤霉素的培养基再换1次，培养观察4d，待未感染细胞在嘌呤霉素作用下全部死亡，再换正常培养基静置培养，每3d换液1次；直到有抗性细胞克隆出现，滤纸片挑取克隆进行扩大培养，得到稳定的感染细胞为长梭形；细胞传至35代时仍然为形态规整的长梭形，周期检测其增殖能力较强，β‑半乳糖苷酶活性很低、不易衰老，具有成骨、成脂肪、成软骨诱导分化能力，能够具备原始细胞表达COL3α1、FGF2、OPN、COL1、α‑SMA、ALP的能力，且生长增殖活跃、具备干细胞活性、表型正常的永生化人牙周膜干细胞特性，具有永生化特征，同时细胞原来具有的干细胞特性并没有改变，仍然可以表达其特异性标记物。