[发明专利]一种阿魏酸生产工程菌株、构建方法及生物转化方法

摘要

本发明公开了一种阿魏酸生产工程菌株、构建方法及生物转化方法，提供的工程菌株整合了新的酶耦联系统，利用强启动子使香兰醇氧化酶基因、松柏醇脱氢酶基因和松柏醛脱氢酶基因在大肠杆菌中共表达，再经过酶促反应催化丁香酚生成阿魏酸。该系统同时耦联木糖还原酶，在生产过程中还原木糖，同时再生氧化型辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，维持阿魏酸生物转化系统的辅酶平衡，从而提高产物阿魏酸的转化率和产量。与目前现有技术相比，本发明对医药中间产物阿魏酸的安全生物转化提供了有效、简单的实施方法，转化率达到95％以上，终产物阿魏酸浓度达到11g/L，具有较高的产业化价值。

主权项

1.一种阿魏酸生产工程菌株构建方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）、用Nde I和Bam HI分别双酶切合成的香兰醇氧化酶基因、松柏醇脱氢酶基因、松柏醛脱氢酶基因和木糖还原酶基因，克隆至用NdeI和Bam HI酶切过的pET24a载体上，得重组载体pET24a‑vaoA，pET24a‑calA、pET24a‑calB和pET24a‑xyl；所述香兰醇氧化酶基因序列表如SEQUENCE LISTING NO：1所示；所述松柏醇脱氢酶基因序列表如SEQUENCE LISTING NO：2所示；所述松柏醛脱氢酶基因序列表如SEQUENCE LISTING NO：3所示；所述木糖还原酶基因序列表如SEQUENCE LISTING NO：4所示；（2）、将重组载体pET24a‑vaoA用Bam HI和Eco RI酶切，回收作为载体，pET24a‑calA用Bgl II和Eco RI酶切，回收大小为900 bp片段，与上述载体连接、转化，得重组载体pET24a‑vaoA‑calA；（3）、将重组载体pET24a‑vaoA‑calA用Bam HI和Eco RI酶切，回收作为载体，pET24a‑calB用Bgl II和Eco RI酶切，回收大小为1.6 kb片段，与上述载体连接、转化，得重组载体pET24a‑vaoA‑calA‑calB；（4）、将重组载体pET24a‑xyl用Bam HI和HindIII酶切，回收作为载体，pET24a‑vaoA‑calA‑calB用Bgl II和HindIII酶切，回收大小为4.1 kb片段，与上述载体连接、转化，得重组载体pET24a‑xyl‑vaoA‑calA‑calB（pET24a‑XVAB）；（5）、将重组载体pET24a‑XVAB转入BL21（DE3），得预期工程菌；步骤（4）具体为：将重组载体pET24a‑xyl用Bam HI和HindIII酶切，酶切体系：DNA 43 μL，buffer R 5 μL，Bam HI 1 μL，HindIII 1 μL，37℃保温3小时，回收作为载体；pET24a‑vaoA‑calA‑calB用Bgl II和HindIII酶切，酶切体系：DNA 43 μL，buffer R 5 μL，BglII 1 μL，HindIII 1 μL，37℃保温3小时，回收大小为4.1 kb片段；所构建的阿魏酸生产工程菌株同时表达香兰醇氧化酶、松柏醇脱氢酶、松柏醛脱氢酶和木糖还原酶，其中，香兰醇氧化酶基因、松柏醇脱氢酶基因、松柏醛脱氢酶基因和木糖还原酶基因上游分别整合T7启动子，在工程菌株中通过T7 RNA 聚合酶启动转录。