[发明专利]一种快速检测地沟油的时间分辨荧光免疫方法及试剂盒

摘要

本发明公开了一种快速检测地沟油的时间分辨荧光免疫方法及试剂盒，本发明方法从地沟油中大量繁殖的细菌种类入手，分析污染地沟油的优势细菌，再确定其特异成分，来达到鉴别地沟油的目的，研究方法非常独特，利用地沟油中优势菌体的脂多糖，筛选单克隆抗体，建立脂多糖的TRFIA检测方法。本发明所述的方法具有对地沟油特异性强和检测灵敏度高的优点，在地沟油的鉴别检测中具有非常重要的意义。

主权项

1.一种快速检测地沟油的时间分辨荧光免疫方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤一：优势菌筛选鉴定：(1) 地沟油生产原料样品前处理：选取四份泔水样品，对每份泔水样品进行4 个梯度的稀释，其中加入石蜡和吐温80 的目的是将油样乳化为水溶性溶液，具体方法如下: 将泔水样品原液每2ml 与1ml 石蜡，2ml 吐温80 及15ml 生理盐水混合，40℃～ 44℃持续震荡至混合均匀，之后每毫升样品加入9 毫升生理盐水，混合均匀后再每毫升样品加入9 毫升生理盐水至混合均匀，备用；(2) 培养细菌：前处理后，将每个样品的稀释前后不同浓度液体分别接种到麦康凯和伊红亚甲蓝两种培养基，具体方法是取液体100μl 加入到培养基中央，然后用L 型玻璃棒将液体均匀涂布到平板上，做好标记，置于电热恒温箱37℃培养，18h ～ 24h 后观察菌落生长情况，将形态相近的菌落归类计数，然后挑选出有代表性的不同形态的菌落接种到血平板，编号并标记来源，置37℃ 18h ～ 24h 做纯化培养；(3) 细菌鉴定：将纯化培养的菌落，对应每个菌落取相应数量的试管，每管加3.5ml 生理盐水，用棉签在血平板上蘸取适量菌溶于管内，控制菌悬液麦氏单位在0.5 ～ 0.63 的范围内，标记后备用，然后将提前半小时从冰箱取出的GN 卡插到管内，放入VITKE2 全自动微生物鉴定系统，完成装载和菌种鉴定；(4) 针对菌种制备特定脂多糖抗体；步骤二、脂多糖单克隆抗体制备及纯化(1)、样品收集：将地沟油样品加入试管中，加入蒸馏水，强烈震荡，待水油分离时取水相备用；(2)、间接竞争免疫分析检测步骤：取脂多糖‑BSA 板条，每孔加入50μl 脂多糖标准或上述步骤二(1) 处理好的样品到各自的微孔中，加缓冲液稀释的抗脂多糖单克隆抗体50μl，25℃振荡0.5h，洗涤液洗3 次，没有连接到固相抗原上的脂多糖抗体在洗涤步骤中被除去，再加分析缓冲液稀释的Eu3+‑ 羊抗鼠抗体100μl，25℃振荡0.5h，用洗涤液洗6 次，加200μl增强液振荡5min 后测量，从标准曲线计算样品中的脂多糖含量。