[发明专利]一种尿液中急性肾损伤生物标志物质谱相对定量方法

摘要

本发明公开了一种尿液中急性肾损伤生物标志物质谱相对定量方法，采用的技术方案是将尿液样本酶解得到多肽片段溶液，用液相色谱‑串联质谱分析多肽片段溶液，然后利用生物信息学的方法对数据进行分析，实现对金属蛋白酶组织抑制物和胰岛素样生长因子结合蛋白7的相对定量。本发明的相对定量方法具有通量高、灵敏度高、重现性好等特点。

主权项

一种尿液中急性肾损伤生物标志物质谱相对定量方法，其特征在于：分别将病人组和正常组的尿液样本酶解得到多肽片段溶液，用液相色谱‑串联质谱分析多肽片段溶液，然后利用生物信息学的方法对数据进行分析，实现对金属蛋白酶组织抑制物和胰岛素样生长因子结合蛋白7的相对定量；所述尿液样本酶解得到多肽片段溶液的步骤包括：样本干燥与复溶、蛋白提取与复溶定量、样本酶切和样本脱盐；所述样本干燥与复溶方法为：收集正常人和急性肾损伤病人的尿液样本进行真空冷冻干燥处理，将冷冻干燥得到的尿液样本用超纯水进行复溶；所述蛋白提取与复溶定量方法为：将复溶的尿液样本用3‑5倍体积的丙酮进行蛋白沉淀，将丙酮沉淀得到的蛋白用超纯水复溶，得到蛋白溶液，然后用Bradford方法初步定量样本中蛋白的含量；所述样本酶切方法为：向定量后的蛋白溶液中加入400uL 50mM的碳酸氢铵溶液，再加入20uL 0.5mg/mL的胰酶溶液，混匀，于37℃孵育12‑16小时，得到多肽片段溶液；所述样本脱盐方法为：首先用100％甲醇平衡C18柱1min，然后将酶切得到的多肽片段溶液注入C18柱中，用超纯水洗脱C18柱2次，然后用80％的乙腈溶液洗脱C18柱，收集洗脱流出液，得到多肽片段溶液；所述液相色谱‑串联质谱分析中，液相色谱条件为：色谱柱：peptide C18柱，50mm×2.1mm I.D.，5um粒径；流动相：甲酸体积百分数占0.1％的水和甲酸体积百分数占0.1％的乙腈，梯度洗脱；柱温40℃；流速500μl/min；进样量20uL；所述的梯度洗脱程序如下：时间0.3min，流速500μl/min，95％A，5％B；时间30min，流速500μl/min，60％A，40％B；时间45min，流速500μl/min，20％A，80％B；时间18min，流速500μl/min，20％A，80％B；时间51min，流速500μl/min，95％A，5％B；时间60min，流速500μl/min，95％A，5％B；其中A是甲酸体积百分数占0.1％的水溶液，B是甲酸体积百分数占0.1％的乙腈混合溶液；质谱条件为：四级杆飞行时间液相色谱‑串联质谱仪，配有电喷雾离子化源和数据处理软件；离子源：电喷雾离子化源；正离子方式检测；离子喷射电压23000V；温度500℃；源内气体1：氮气压力15psi；源内气体2：氮气压力0psi；气帘气体：氮气压力30psi；扫描方式为多重反应监测；所述的生物信息分析方法为：用ProteinPilot做数据检索，同时用skyline做非标记定量，根据数据检索和分析的结果计算出样本中金属蛋白酶组织抑制物和胰岛素样生长因子结合蛋白7的相对含量。