[发明专利]基于灵芝菌丝分泌酶的灵芝孢子粉优化破壁方法

摘要

一种生物工程领域的基于灵芝菌丝分泌酶的灵芝孢子粉优化破壁方法，通过将灵芝孢子粉和基于灵芝菌丝体接种发酵得到的粗酶液混合配制成悬浮液，经高压均质机破壁处理后浓缩干燥得到破壁孢子粉。本发明依据生物转化原理利用灵芝菌丝诱导产酶、并利用粗酶液辅助灵芝孢子粉的破壁，灵芝菌丝发酵粗酶液‐孢子粉的复合物中灵芝β‐葡聚糖和三萜类成分的含量明显增加，且安全、易于吸收，可用于保健食品和药物开发等。

主权项

1.一种基于灵芝菌丝分泌酶的灵芝孢子粉优化破壁方法，其特征在于，通过将灵芝孢子粉和基于灵芝菌丝体接种发酵得到的粗酶液混合配制成悬浮液，经破壁均质处理后浓缩干燥得到破壁孢子粉，所述的粗酶液是指：采用灵芝菌丝体依次在诱导产酶培养基、灵芝预培养培养基和产酶培养基中培养后得到的上清液；所述的灵芝是指：中国农业微生物菌种保藏中心的灵芝51562或灵芝00679菌株；所述的接种发酵包括：①预培养，是指在无菌条件下，将灵芝菌丝体按照5‑10％的量(v/v)接入诱导产酶培养基中诱导培养；②扩大培养，是指将预培养后的菌种接入含有液态的灵芝预培养培养基的容器中，经两阶段旋转培养后取上清液得到；③发酵，是指将步骤②得到的上清液加入产酶培养基进行旋转培养后离心处理得到上清液；所述的诱导产酶培养基，即PDA固体培养基，通过以下方式制备得到：去皮马铃薯200g用700‑800mL蒸馏水煮30‑40min至烂，用4层纱布过滤后溶入葡萄糖20g，KH₂PO₄ 5g，MgSO₄·7 H₂O3g，维生素B₁ 0.01g，定容至1000mL，调pH值至6.5‑7.0，加入琼脂粉16～18g，121℃、1.034×10⁵Pa、20min高压灭菌，冷至60℃时倒平板；所述的灵芝预培养培养基通过以下方式制备得到：称取蔗糖35g，蛋白胨5g；酵母粉25g；KH₂PO₄·H₂O 1g；MgSO₄·7H₂O 0.5g；维生素B₁ 0.05g于烧杯中，加入800mL去离子水，充分搅拌溶解，再补水至1000mL；调pH值到5.5，121℃、1.034×10⁵Pa、20min高压灭菌；所述的两阶段旋转培养是指：用接种铲将1cm²左右的平板菌种接至装有20‑40mL液体灵芝预培养培养基的150mL三角瓶中捣碎；静置2‑3d活化后，将三角瓶放入28℃恒温振荡器中120rpm培养4‑6d；然后将150mL三角瓶中的培养物转入含有液体灵芝预培养培养基的三角瓶中，放入28℃恒温振荡器中120rpm培养5‑7d，备用；所述的产酶培养基，即灵芝菌株MnP产酶培养基，其每升组分含量为：磷酸二氢钾1.0g，磷酸氢二钾0.4g，硫酸镁0.5g，氯化钙0.013g，酵母膏0.1g，氮元素26mmol或硝酸铵0.5g与L‑天冬酰胺1.5g的组合，维生素B₁ 0.0025g，吐温‑80 2.0mL，微量元素溶液1.0mL，1％W/V的葡萄糖10g，用2mol/L的氢氧化钾和2mol/L的盐酸将培养基调至pH6.0，其中每升微量元素溶液配方为：柠檬酸铁4.8g，七水硫酸锌2.64g，四水二氯化锰2.0g，六水二氯化钴0.4g，五水硫酸铜0.4g；所述的离心处理是指：在4℃环境下以3000g离心机中离心5min；所述的破壁均质是指：将收集的孢子粉加入粗酶液中，经充分震荡后通过高压均质实现破壁，得到孢子粉悬浊液；所述的充分震荡是指：在25‑28℃的恒温摇床中充分震荡6‑12h；所述的高压均质是指：在4℃、1000MPa的环境下均质破壁并循环5次；所述的浓缩干燥是指：浓缩时采用减压浓缩，温度在55℃以下；使用微波真空低温干燥机干燥，干燥温度在55℃以下。