[发明专利]一种从人脐带中提取间充质干细胞的方法

摘要

本发明涉及干细胞及组织工程领域，特别是一种从人脐带中提取间充质干细胞的方法,针对现有人脐带间充质干细胞的分离，培养技术中存在的问题与不足，其解决问题的技术方案是：一种人脐带间充质干细胞的分离方法，由下述步骤组成：一：脐带组织块制备；二：组织块消化；三：过滤消化液离心收集细胞；四：合并细胞沉淀，离心，收集细胞；五：传代培养；六：使用程序降温仪冻存细胞，放入液氮中冻存；本发明既减少了成本又可以快速获得间充质干细胞，减少对细胞的伤害，提高冻存年限和细胞活性，缩短了操作流程，减少污染，而且能够提高细胞纯度。

主权项

一种人脐带间充质干细胞的分离方法，其特征在于由下述步骤组成：步骤一： 将在无菌条件下获得的脐带用磷酸盐缓冲液清洗血迹，然后在培养皿中用酒精棉球消毒脐带，剪成2cm的小段，擦拭掉脐带里面以及外面残留的血液，再剖除动、静脉以及脐带外膜，制成组织块；步骤二： 将步骤一中获得的脐带组织块剪成1mm3大小的碎块放入50ml离心管中，加入等体积的胶原酶I，置于37℃培养箱中持续消化3‑10h；步骤三：加入8‑10倍消化液体积的生理盐水稀释步骤二中的消化液，200目筛网过滤，800g，15min离心收集细胞；步骤四：合并细胞沉淀，再加入2倍体积的生理盐水冲洗细胞，500g，5min离心，收集细胞；步骤五：使用添加有5%组成为：3%‑6%结合蛋白；0.5%‑1.5%生长因子；0.5%‑1.5%（组氨酸：脯氨酸3：1）；0.03%‑0.07%固醇类激素；0.1%‑0.5%【（维生素B1：维生素B2：维生素B6：维生素B12  1：1：1：1）： 维生素C ：维生素D ：维生素E 1：1：1：1】；0.01%‑0.03%（铁：锌：钼：钴2：2：1：1）；0.5%‑1.5%粘附因子；87.4%‑95.36%去离子水的血清替代物的MEM‑α培养基重悬细胞并接种于10cm细胞培养皿中，于37℃、体积分数为5%CO2培养箱内进行培养，3‑4d后添加新鲜的含有5%血清替代物的MEM‑α培养基，待细胞达到80%融合时用0.05%胰酶消化，传代培养；步骤六：待细胞扩增至3‑6×107个时用0.05%胰酶消化，800g，15min离心收集细胞，用新鲜的含有5%血清替代物的MEM‑α培养基重悬，加入冻存保护剂并使用程序降温仪冻存细胞，程序为：以1℃/min的速率降至‑5℃后，以3℃/min的速率降至‑20℃，再以1℃/min的速率降至‑60℃，最后以5℃/min的速率降至‑120℃，结束后放入液氮中冻存。