[发明专利]一种利用多重皱纹盘鲍荧光标记微卫星进行家系识别和亲权鉴定的方法

摘要

本发明属于海洋生物技术领域，具体的说是一种利用多重皱纹盘鲍荧光标记微卫星进行家系识别和亲权鉴定的方法。以标记荧光基团的皱纹盘鲍微卫星，采用多重PCR反应，进而高通量地用于皱纹盘鲍不同家系的区分或者皱纹盘鲍亲权鉴定。本发明的两个组合均将原来9次微卫星PCR扩增和检测整合到1次，降低了检测成本、提高了工作效率。利用ABI 3730xl全自动DNA测序仪进行微卫星分型，规避了变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离、银染显色带来的分型误差，提高了亲权鉴定的准确性。该发明的建立也将使研究皱纹盘鲍遗传学数据分析更加标准化和规范化，利于不同研究者之间的数据交流和共享。

主权项

一种利用多重皱纹盘鲍荧光标记微卫星进行家系识别和亲权鉴定的方法，其特征在于：以标记荧光基团的皱纹盘鲍微卫星引物，采用多重PCR反应，进而高通量地用于皱纹盘鲍不同家系的区分或者皱纹盘鲍亲权鉴定；具体为将荧光基团标记于从皱纹盘鲍遗传图谱连锁群上获得的微卫星引物上，构建两组多重微卫星PCR体系，得到的PCR样品利用ABI 3730xl全自动DNA测序仪进行微卫星分型，ROX荧光分子作为内标，利用GeneMarker V1.75软件获得微卫星分型数据，并根据微卫星标记的孟德尔分离定律将数据通过Package for the Analysis of Parental Allocation软件，处理无效等位基因位点以及检测出可能存在的分型失误，进而高通量地用于皱纹盘鲍不同家系的区分或者皱纹盘鲍亲权鉴定；所述标记荧光基团的皱纹盘鲍微卫星引物分别为：组合一为：皱纹盘鲍微卫星标记HD12正向引物(5’‑3’)：FAM‑TGGATCTGCTGTTTGTCAC，反向引物(5’‑3’)：GGCTAATGTCCACTACTTTC；皱纹盘鲍微卫星标记CHh157正向引物(5’‑3’)：FAM‑ATAATAAACAGCATTGGCGGACG，反向引物(5’‑3’)：CCACCCCTACTCCTAAATATTTTGG；皱纹盘鲍微卫星标记CHh104正向引物(5’‑3’)：FAM‑TGGCAATGTGGATTTTGTTGATG，反向引物(5’‑3’)：GCTTCGATAAGCATTCTACATGGAG；皱纹盘鲍微卫星标记CHh012正向引物(5’‑3’)：HEX‑GCAATCTAACCTATTCAGCCACC，反向引物(5’‑3’)：GAACATAAGCAACATCACCATCA；皱纹盘鲍微卫星标记Awb039正向引物(5’‑3’)：HEX‑TCGTTGTTCAAAGATAAAGATGTGA，反向引物(5’‑3’)：CTTACGTCCAGTGTTATGCGGTCTC；皱纹盘鲍微卫星标记CHd533正向引物(5’‑3’)：HEX‑TCGTATCTCAGTAGGCTGGCAT，反向引物(5’‑3’)：TTGTTCATTCTTGATTATTATCGTG；皱纹盘鲍微卫星标记KHdh86正向引物(5’‑3’)：TAM‑AGTTGTTGAACCTTTCTGTTG，反向引物(5’‑3’)：GAAAACTTCACCCACTACTTG；皱纹盘鲍微卫星标记CHh139正向引物(5’‑3’)：TAM‑TTTGCTAAAGCTGCGACATCGTATC，反向引物(5’‑3’)：CTTCTGTATTTCATGGTGTCCGTGG；皱纹盘鲍微卫星标记CHh001正向引物(5’‑3’)：TAM‑GAAGCAAAACCAGATGCCAAGGAGG，反向引物(5’‑3’)：TTCAAGGTAGCAGCAACAGCAACGAC；组合二为：皱纹盘鲍微卫星标记CHh011正向引物(5’‑3’)：FAM‑GATCTTTATTTGGCAAACTAA，反向引物(5’‑3’)：TGAAACCTGATACTGGTAAGC；皱纹盘鲍微卫星标记Eab630正向引物(5’‑3’)：FAM‑GTACTTGTTGTTACCTTGGCATTC，反向引物(5’‑3’)：ACGTAGACTTACGATAGTCATAGC；皱纹盘鲍微卫星标记CHh165正向引物(5’‑3’)：FAM‑CGTACCCCCTGTTGTGGTAGTAGAT，反向引物(5’‑3’)：TGTAGTGTTATACCAGTAGACGGCG；皱纹盘鲍微卫星标记CHh107正向引物(5’‑3’)：HEX‑GGTCCTCTGTGGTCTGAAGCAAC，反向引物(5’‑3’)：TCAAGCATATCATACTTTGTACTACGCAC；皱纹盘鲍微卫星标记CHh036正向引物(5’‑3’)：HEX‑GCTTAGTCAGACCTGAAGGATACC，反向引物(5’‑3’)：GTTCTACTCACTGTAAAACAATCAATG；皱纹盘鲍微卫星标记CHh193正向引物(5’‑3’)：HEX‑TAACACCTGCGTCGTCTTCGTC，反向引物(5’‑3’)：TATCACAATTATTCCACAACCTTATGT；皱纹盘鲍微卫星标记Tr001正向引物(5’‑3’)：TAM‑ATGTGAATGCACGTCACTATG，反向引物(5’‑3’)：ATAACTGTCTTAGCACTAGGATTG；皱纹盘鲍微卫星标记CHh170正向引物(5’‑3’)：TAM‑GGTATCCCAAAACATTTTCTGAGCA，反向引物(5’‑3’)：GTTAGTGACCCCAAAAGTTCATCCA；皱纹盘鲍微卫星标记CHh175正向引物(5’‑3’)：TAM‑TTTACTGGATGTGAAACAGTGACAC，反向引物(5’‑3’)：ATTGACTAGGAAGATGAGAAGCTGA；所述多重PCR反应体系为Taq DNA Master Mix(ABI)7.5ul,Primer Mix 1ul，GC Enchaner 1.5ul，模板DNA40‑80ng/ul 1ul，双蒸水补齐至15ul；PCR反应条件为94℃变性4min，然后进行13个循环94℃变性30s；退火温度从59℃降至53℃，每1个循环退火温度降低0.5℃，退火时间为45s；72℃延伸45s，紧接着进行22个循环94℃变性30s；53℃退火45s；72℃延伸45s，最后，72℃延伸10min，4℃保存。