[发明专利]一株胞内表达枯草芽孢杆菌漆酶的基因工程菌株及实现该菌株胞外释放重组漆酶的诱导方法

摘要

实现一株胞内表达枯草芽孢杆菌漆酶的基因工程菌株及高效产胞外漆酶的诱导方法，涉及一株胞内表达枯草芽孢杆菌漆酶的基因工程菌株及实现该菌株高效释放重组漆酶到培养基中的诱导方法。该基因工程菌株的制备方法一、芽孢杆菌基因组DNA的提取和细菌漆酶基因的克隆；二、重组表达菌株的构建。实现重组漆酶高效产胞外漆酶的诱导方法一、将工程菌株接入LB培养基培养至OD600为0.8；二、加入0.1mM IPTG和0.1mM CuSO4，25℃，120rpm培养4h，随后在30℃下静止培养。本发明所提供的诱导方法可有效将重组胞内漆酶释放到培养基中，相较于传统大肠杆菌分泌表达漆酶，其胞外漆酶产量得到显著提高，操作简单，对于工业大规模发酵胞外漆酶具有很好的参考价值。

主权项

一种有效实现大肠杆菌基因工程菌株大量胞外表达漆酶的诱导方法，其特征在于该方法是在一株胞内表达枯草芽孢杆菌漆酶的大肠杆菌基因工程菌株基础上实现的，菌株的制备方法如下：一、芽孢杆菌基因组DNA的提取和细菌漆酶基因的克隆：提取枯草芽孢杆菌LS02的基因组DNA，以基因组DNA为模板，采用引物LS02‑F 5’‑GGAATTCCATATGACACTTGAAAAATTTGTGGATGC‑3’和LS02‑R 5’‑CGCGGATCCGGTTTATGGGGATCAGTTATATCC‑3’进行PCR扩增，扩增产物经纯化后连接于pEASY‑Blunt克隆载体上，得到重组载体pEASY/CotA，以pEASY/CotA为模板，采用点突变引物LS02‑Mut‑F 5’‑ATTGACTTCACAGCATACGAAGGAGAATCGATC‑3’和LS02‑Mut‑R 5’‑GTATGCTGTGAAGTCAATGATGATATCATAAC‑3’，PCR扩增全质粒，利用全式金DMT酶消化PCR产物，随后将消化产物导入大肠杆菌DMT感受态细胞，通过蓝白斑筛选阳性克隆转化子，测序验证，获得载体pEASY/CotA‑Mut；将载体pEASY/CotA‑Mut和载体pET‑20b(+)分别经NdeI和BamHI双酶切，将含有粘性末端的酶切片段CotA‑Mut和pET‑20b(+)通过T4DNA连接酶连接，构建重组表达载体pET/CotA‑His6，转入大肠杆菌Top10感受态细胞，通过Amp抗生素筛选获得阳性转化子并测序验证，将测序成功的重组表达载体转入大肠杆菌BL21(DE3)，通过含Amp抗生素的LB固体培养基筛选阳性表达菌株，命名为PSD；二、实现PSD菌株胞外释放重组漆酶的诱导条件如下将重组表达菌株PSD甘油菌接入含50mg/L Amp的LB培养基中，在37℃、180rpm条件下过夜培养12～14h，得菌液；将过夜培养的菌液按照1％接种量接种至含50mg/L Amp的新鲜LB培养基，在30℃、180rpm条件下培养至OD600为0.8，加入0.1mM IPTG和0.1mM CuSO4，置于25℃条件下120rpm培养4h，随后在30℃下静止培养20h，即可在培养基上清中检测到重组漆酶活性。