[发明专利]一种快速筛选分离异养硝化-好氧反硝化细菌的方法

摘要

本发明公开了一种快速筛选分离异养硝化-好氧反硝化细菌的方法，按照下述步骤进行：1、目标微生物的富集培养；2、利用目标微生物生理上的特性对目标菌种进行初步筛选；3、利用选择培养基对目标菌种进一步驯化筛选；4、利用平板划线的方法对目标菌株进行纯化；5、目标菌种纯度的验证。本发明能够筛选分离异养硝化-好氧反硝化菌种，该方法具有快速、简单、对实验条件要求不高的优点。本发明有希望成为实现短程硝化反硝化的先决条件之一，同时也是实现优化传统脱氮工艺需要克服诸多关键技术之一，在实际工程中有较大的发展潜力。

主权项

一种快速筛选分离异养硝化‑好氧反硝化细菌的方法，其特征在于：步骤如下，1）目标微生物的富集培养：将从污水厂二沉池取来的水样震荡混匀后，取1ml接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，在30～35℃、90～120rpm的条件下恒温震荡培育24～72h，得到培养液Ⅰ；2）目标菌种的初步筛选：对培养液Ⅰ分别进行梯度为10‑2、10‑3、10‑4、10‑5、10‑6、10‑7、10‑8、10‑9倍的稀释；将稀释后得到的八个不同浓度的培养液分别接种于液体培养基Ⅰ中，接种量为每200ml培养基中接种1ml稀释后的培养液Ⅰ，在30～35℃、90～120rpm的条件下恒温震荡培育7～10d，得到培养液Ⅱ，测试各培养液Ⅱ培养前后的pH值；3）目标菌种的进一步筛选：将pH值相对培养前降低幅度最大的培养液Ⅱ样品取0.1～1ml涂布接种到固体培养基Ⅰ平板中，平板倒置在30～35℃恒温培养箱培养2～4d；挑取平板中菌落周围培养基颜色发生变化的单个菌落分别于装有液体培养基Ⅱ的试管中，各自在30～35℃、90～120rpm的条件下恒温震荡培育3～5d，当试管内壁液体与空气接触部分形成明显的生物环时，得到培养液Ⅲ，此时检测每个试管中氨氮和总氮的去除效果，将对氨氮和总氮有去除效果的培养液Ⅲ稀释后采用平板划线的方法接种到固体培养基Ⅱ平板中，平板倒置在30～35℃恒温培养箱培养2～4d；挑取固体培养基Ⅱ平板中的单个菌落分别于装有液体培养基Ⅲ的试管中，在30～35℃、90～120rpm的条件下恒温震荡培育3～5d，当试管内壁液体与空气接触部分形成明显的生物环时，得到培养液Ⅳ，此时检测每个试管中硝态氮和总氮的去除效果；4）目标菌种的纯化：将对硝态氮和总氮有明显去除效果的菌株进行纯化，利用平板划线的方法将稀释后的培养液Ⅳ接种到固体培养基Ⅱ平板中，平板倒置在30～35℃恒温培养箱培养2～3d；挑取固体培养基Ⅱ平板中的单个菌落分别于装有液体培养基Ⅲ的试管中，在30～35℃、90～120rpm的条件下恒温震荡培育3～5d，当试管内壁液体与空气接触部分形成明显的生物环时，得到培养液Ⅴ，此时检测每个试管中硝态氮和总氮的去除效果；将对硝态氮和总氮有明显去除效果的培养液Ⅴ稀释后利用平板划线的方法接种到固体培养基Ⅲ平板中，平板倒置在30～35℃恒温培养箱培养2～3d；挑取固体培养基Ⅲ平板中的单个菌落分别于装有液体培养基Ⅱ的试管中，在30～35℃、90～120rpm的条件下恒温震荡培育3～5d，当试管内壁液体与空气接触部分形成明显的生物环时，得到培养液Ⅵ，此时检测每个试管中氨氮和总氮的去除效果；重复以上操作，直至检测到的硝态氮、氨氮与总氮的去除效果达到稳定为止；5）目标菌种纯度的验证：利用分子生物学中每个物种DNA的特异性，采用PCR‑DGGE的技术手段对去除效果达到稳定的菌种进行检测；PCR扩增对象为细菌16S rRNA，上游引物为341f‑GC，5’>CCTACGGGAGGCAGCAG <3’,下游引物907r，5’>CCGTCAATTCCTTTGAGTTT<3’；扩增程序:95℃预变性4min, 然后按95℃变性30s；低温退火45s；72℃延伸1min进行20个循环，该20个循环第一次退火温度为65℃，以后每个循环依次降低0.5℃，最终达到55℃的退火温度，再于该恒定退火温度下进行15个循环，该15个循环95℃变性30s；55℃退火45s；72℃延伸1min，最终72℃延伸7 min；对PCR产物进行以浓度为6%丙烯酰胺为底物配制的梯度为40%～75%的变性梯度凝胶电泳实验检验；若在变性梯度凝胶电泳实验中出现单一条带，认为检测目标为单一菌种，即得到纯化目标菌种；若出现多条条带则检测目标不是单一菌种，则重复步骤4）进一步纯化，直到出现单一条带；    液体培养基Ⅰ构成为：KNO3 0.5778g；柠檬酸三钠‑C 200mg；C6H12O6‑C 200mg；琥珀酸钠‑C 200mg；乙酸钠‑C 200mg；NaCl 4g；六种微量元素水溶液各3～5ml；H2O 1000ml；pH=7.0～8.0，110℃高压蒸汽灭菌15min；    固体培养基Ⅰ构成为：NH4Cl 0.3057g；C6H12O6‑C 800mg；NaCl 4g；溴百里酚蓝试剂 1ml；琼脂粉15～20g；六种微量元素水溶液各3～5ml；H2O 1000ml；pH=7.0～8.0，110℃高压蒸汽灭菌15min；其中溴百里酚蓝试剂为0.1～0.3g溴百里酚蓝溶于10～15ml无水乙醇中制成；   液体培养基Ⅱ构成为：NH4Cl 0.3057g；C6H12O6‑C 800mg；NaCl 4g；六种微量元素水溶液各3～5ml；H2O 1000ml；pH=7.0～8.0，110℃高压蒸汽灭菌15min；    固体培养基Ⅱ构成为：NH4Cl 0.3057g；C6H12O6‑C 800mg；NaCl 4g；琼脂粉15～20g；六种微量元素水溶液各3～5ml；H2O 1000ml；pH=7.0～8.0，110℃高压蒸汽灭菌15min；   液体培养基Ⅲ构成为：KNO3 0.5778g；C6H12O6‑C 800mg；NaCl 4g；六种微量元素水溶液各3～5ml；H2O 1000ml；pH=7.0～8.0，110℃高压蒸汽灭菌15min；    固体培养基Ⅲ构成为：KNO3 0.5778g；C6H12O6‑C 800mg；NaCl 4g；琼脂粉15～20g；六种微量元素水溶液各3～5ml；H2O 1000ml；pH=7.0～8.0，110℃高压蒸汽灭菌15min；所述六种微量元素水溶液由MgSO4·7H2O 3.0135g、MnSO4·H2O 3.36g、H3BO3 1.12g、ZnSO4·7H2O 3g、 FeSO4·7H2O 0.3g、CaCl20.6g分别溶于1000ml H2O所得。