[发明专利]黑果枸杞遗传转化体系建立的方法及其应用

摘要

本发明公开了黑果枸杞遗传转化体系建立的方法及其应用。本发明所提供的黑果枸杞遗传转化体系建立的方法，包括如下步骤：(1)将含有目的DNA的质粒导入农杆菌得到重组农杆菌；(2)培养重组农杆菌用作转化侵染液；(3)用侵染液浸泡黑果枸杞外植体；(4)将外植体放置于共培养培养基共培养；(5)将共培养后的外植体转移至愈伤组织诱导及筛选培养基上培养，并去除农杆菌；(6)以卡那霉素作为筛选压力，诱导抗性愈伤组织；(7)将抗性愈伤组织转入分化培养基培养，得到丛生芽；(8)诱导生根，即得到黑果枸杞抗性再生苗，抗性苗经PCR鉴定为阳性转基因苗。本发明所提供的黑果枸杞的遗传转化方法，操作简单易行，愈伤组织存活率高。

主权项

1.一种建立黑果枸杞遗传转化体系的方法，包括如下步骤：(1)将含有目的基因NahG的质粒导入农杆菌得到重组农杆菌；将所述重组农杆菌在含有卡那霉素的LB液体培养基中于28℃振荡培养24‑36小时；所述农杆菌为农杆菌GV3101菌株；所述含有卡那霉素的LB液体培养基中各成分的浓度为：卡那霉素50mg/L、胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L和氯化钠10g/L；(2)取所述步骤(1)的菌液于含有卡那霉素的LB液体培养基中，28℃振荡培养至OD600值为0.5‑0.7，离心收集菌体；所述含有卡那霉素的LB液体培养基中各成分的浓度为：卡那霉素50mg/L、胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L和氯化钠10g/L；(3)用LB液体培养基重悬所述步骤(2)收集的菌体，28℃继续振荡培养至菌液OD600值分别为0.6，用作侵染液；(4)用所述步骤(3)的侵染液浸泡黑果枸杞外植体20分钟，得到侵染后的黑果枸杞外植体；所述黑果枸杞外植体为黑果枸杞叶片；(5)将所述步骤(4)得到的侵染后的黑果枸杞外植体放置于共培养培养基上于黑暗中共培养2‑4天，得到共培养物；所述共培养培养基为：MS基本培养基，附加30g/L蔗糖、6.0g/L琼脂粉和0.2mg/L 2,4‑D；(6)将所述步骤(5)得到的共培养物用含有500mg/L头孢霉素的无菌水清洗后转移至含有20mg/L卡那霉素和300mg/L头孢霉素的愈伤组织诱导及筛选培养基上培养10‑14天，得到去除农杆菌后的愈伤组织；所述愈伤组织诱导及筛选培养基为：MS基本培养基，附加30g/L蔗糖、6.0g/L琼脂粉、0.2mg/L 2,4‑D、20mg/L卡那霉素和300mg/L头孢霉素；(7)将所述步骤(6)得到的去除农杆菌后的愈伤组织在头孢霉素浓度递减的愈伤组织诱导及筛选培养基上培养2‑3周，得到抗性愈伤组织；(8)将所述步骤(7)得到的抗性愈伤组织转入选择和分化培养基上培养6‑8周，得到丛生芽；所述选择和分化培养基为：MS基本培养基，附加30g/L蔗糖、6.0g/L琼脂粉、2.0mg/L 6‑BA、20mg/L卡那霉素和150mg/L头孢霉素；(9)将所述步骤(8)得到的丛生芽在生根诱导培养基上诱导生根，即得到黑果枸杞的抗性再生苗；所述生根诱导培养基为：MS基本培养基，附加30g/L蔗糖、6.0g/L琼脂粉和0.2mg/Lα‑萘乙酸。