[发明专利]快速鉴别三叶青及其多种伪混品的PCR‑RFLP方法

摘要

本发明属于分子标记领域，公开了一种快速鉴别三叶青及其伪混品的PCR‑RFLP方法，包括1、提取药材DNA；2、用一对扩增核糖体DNA的内转录间隔区ITS2序列的正反向引物进行PCR扩增；3、限制性内切酶NCO I消化PCR产物；4、琼脂糖凝胶电泳分析。药材三叶青DNA扩增产物酶消化后产生2条DNA片段，大小分别为335bp和200bp左右，而各种伪混品均不被NCO I酶识别。本发明利用三叶青与其伪混品DNA序列的差异，建立了快速、便捷、可靠的PCR‑RFLP鉴别方法,可鉴别三叶青药材及是否混入了伪混品，克服了感官或理化分析等方法难以鉴别三叶青真伪的技术问题，保障了三叶青药材用药安全。

主权项

一种快速鉴别三叶青及其伪混品的PCR‑RFLP方法，包括提取药材DNA和琼脂糖凝胶电泳分析，其特征在于，用一对扩增核糖体 DNA 的内转录间隔区序列的正反向引物进行PCR扩增及用限制性内切酶消化PCR产物，根据酶消化产物琼脂糖凝胶电泳分析结果判断药材三叶青的真伪及是否掺入了伪混品，其判断标准为酶消化后药材三叶青样品电泳分析出现335bp和200bp条带，而其伪混品的DNA扩增产物不被限制性内切酶消化；所述的三叶青伪混品是土圞儿、乌头、大青藤、三叶青近缘植物扁担藤、毛枝崖爬藤；上述PCR扩增引物为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所述的核苷酸序列，其中正向引物为SEQ ID NO.1 所示的核苷酸序列，反向引物为SEQ ID NO.2 所示的核苷酸序列；使用的限制性内切酶为NCOⅠ，其识别序列为CCATGG。