[发明专利]一种利用细胞膜荧光染料在体内外定量测定细胞增殖速度的方法

摘要

本发明公开了一种利用细胞膜荧光染料在体内外定量测定细胞增殖速度的方法，包括如下步骤：a）细胞膜荧光染料染细胞；b）不同浓度血清的培养基培养染色后细胞；c）收取细胞，计数并检测每个细胞平均荧光强度，根据荧光强度和细胞分裂次数利用统计软件获得对数拟合公式，绘制标准曲线；通过每个细胞平均荧光强度和细胞分裂次数的标准曲线，可测定体内外一群细胞或细胞亚群的增殖速度。本方法可应用于体外细胞分裂次数的定量检测、体外肿瘤细胞亚群耐化疗药物的定量测定、体内移植细胞的分裂速度，并能分选各个分裂速度不同的细胞亚群，测定分选后细胞的RNA、蛋白和生物功能。

主权项

一种利用细胞膜荧光染料在体内外定量测定细胞增殖速度的方法，其特征在于：为如下步骤：以细胞膜荧光染料染细胞：取细胞膜荧光染料配制成储存浓度为1mmol/L的染液，将储存浓度为1mmol/L的染液加入到无血清培养基中配制成工作浓度为5~10umol/L的染液，再将工作浓度为5~10umol/L的染液与重悬于无血清培养基的细胞悬液按体积比1:1混合，并轻轻吹打，使充分混匀，然后置于37℃孵箱孵育2~30min，完成细胞染色；所述孵育时间大于10min时，每10min将染液与细胞悬液轻轻吹打，混匀一次；染色后细胞的培养：配制含不同血清浓度的培养基，将各培养基分别加入细胞培养板中，每孔2ml，每种血清浓度设立两个复孔，将染色后的细胞以5×104个/孔的密度平均铺于上述事先加入了含不同血清浓度培养基的细胞培养板中，在37°C、5% CO2、饱和湿度条件下进行染色后细胞的常规培养；标准曲线绘制：培养一周后，收取细胞，用细胞计数板计数每孔细胞数目，以流式细胞仪检测每孔细胞的平均荧光强度；以M末为平均荧光强度，S表示细胞分裂次数，利用R软件经统计分析，建立细胞分裂次数S与细胞平均荧光强度M末的对数拟合关系式：S=Alog2 M末+B，并利用excel绘制出对数拟合曲线；所述对数拟合关系式中的系数A和B为常数，由统计分析获得；所述收取细胞的方法是：以浓度0.05%的胰酶细胞消化液Trypsin‑EDTA消化细胞1~3min，然后置于流式管中，以1000~1200rpm转速离心3~8min，小心去上清后重悬于200~500ulPBS磷酸盐缓冲液中，重悬的缓冲液体积取决于细胞数量，调整细胞密度至1×106/ml；体内外细胞增殖速度的定量测定：测定待测细胞的平均荧光强度M末，然后根据步骤（3）中建立的细胞分裂标准曲线或对数拟合关系式，计算得到细胞分裂次数S。