[发明专利]一种苹果花粉管微丝的标记方法

摘要

本发明公开了一种苹果花粉管微丝的标记方法，是将苹果花粉经过培养、固定、酶处理、表面活性剂处理和染料标记步骤后封片进行扫描成像。本发明的有益效果为：本发明在梨花粉微丝标记的方法基础之上结合裸子植物花粉管微丝的标记方法进行借鉴与改进，通过固定、酶解细胞壁、表面活性剂使染料更容易进入胞内，运用FITC-Phalloidin标记，避免了应用TRITC-Phalloidin由于酶解不充分导致细胞外壁自发荧光的干扰，可以得到保存相对完好的苹果花粉微丝，且具有高效、快速的特点，可以获得更加清晰、明亮的图片，填补了苹果花粉管微丝标记的空白，为蔷薇科乃至被子植物花粉管中微丝的标记提供参考，应用价值高。

主权项

一种苹果花粉管微丝的标记方法，其特征在于，包括以下步骤：1）苹果花粉培养：将储存在‑20℃的花粉取出回温，采用液体培养法，称取花粉10mg，悬浮于10ml培养基中，温度30℃，100rpm/min振荡暗培养，培养基组成为：20%蔗糖+0.015%CaCl2+0.01%H3BO3；2）固定：用含有质量百分含量为4%的多聚甲醛洗步骤1）得到的培养好的苹果花粉两次，固定1.5h，同时真空抽气10‑15min，得到固定后花粉，所述4%的多聚甲醛是用pH值为6.9的50mM PIPES缓冲液配置的；3）酶处理：将步骤2）得到的固定后花粉以50mM的PIPES缓冲液洗涤三次，再将洗涤后的花粉置于含有质量百分含量1%的果胶酶和质量百分含量1%的纤维素酶的50mM PIPES缓冲液中，37℃培养15‑20min，得到酶处理后花粉；4）将步骤3）得到的酶处理后花粉以50mM PIPES缓冲液洗涤三次后，再置于体积百分含量为1%的Triton X‑100溶液中，室温孵育1‑2h，得到孵育花粉；5）将步骤4）得到的孵育花粉以200nM Alexa Fluor 488 phalloidin标记，标记过程为200nM Alexa Fluor488 phalloidin是以PBS缓冲液稀释的，pH值为6.9，置于暗培养环境下培养2h，直接观察或以4℃过夜后观察再以甘油封片即可得到标记花粉封片；6）将步骤5）得到的标记花粉封片利用Leica TCS SP5激光共聚焦扫描成像系统，FITC，Ar激光，波长488nm，每个样品取180‑200个不同光学切片扫描，再将所有光学切片叠加成像即可。