[发明专利]活细胞水平上改变基因启动子内特定顺式作用元件甲基化修饰水平的方法

摘要

本发明公开了活细胞水平上改变基因启动子内特定顺式作用元件甲基化修饰水平的方法。所述的方法包括以下步骤：(1)构建目的基因野生型启动子荧光素酶载体；(2)构建带有特定限制性内切酶位点的目的基因突变型启动子荧光素酶载体；(3)获得目的基因启动子区仅特定顺式作用元件高甲基化(>90％)的环形pGL3质粒。将所得环形质粒直接转染U251细胞，利用荧光素酶报告系统分析各顺式作用元件甲基化修饰改变对基因启动子活性的影响。通过特定序列甲基化再环形质粒法，实现了活细胞内目的基因启动子上特定顺式作用元件甲基化修饰水平的改变，以此方法可深入探讨同一启动子内不同顺式作用元件甲基化修饰水平变化对基因转录活性的影响。

主权项

活细胞水平上改变基因启动子内特定顺式作用元件甲基化修饰水平的方法，其特征在于包含以下步骤：(1)构建目的基因的野生型启动子荧光素酶载体：合成目的基因野生型启动子，将其克隆到荧光素酶载体中，获得目的基因野生型启动子荧光素酶载体；(2)构建带有特定限制性内切酶位点的目的基因突变型启动子荧光素酶载体：以目的基因野生型启动子荧光素酶载体为模板，利用基因定点突变和拼接PCR法，获得目的基因突变型启动子序列，使该启动子内各顺式作用元件两端都带有甲基化不敏感的单一限制性内切酶位点，将该突变启动子克隆至荧光素酶载体获得带有特定限制性内切酶位点目的基因突变型启动子荧光素酶载体；(3)目的基因启动子区不同顺式作用元件的甲基化修饰：利用目的基因突变型启动子区各顺式作用元件两端特定的甲基化不敏感的单一限制性内切酶位点对应的内切酶大量双酶切带有特定限制性内切酶位点的目的基因突变型启动子荧光素酶载体，分别纯化回收载体骨架和各顺式作用元件，随后利用CpG甲基转移酶对各顺式作用元件进行甲基化处理，并通过T4连接酶将甲基化的各顺式作用元件分别接回相应的荧光素酶载体骨架上，获得基因启动子区仅特定顺式作用元件高甲基化的环形荧光素酶质粒；其中所述的高甲基化是指甲基化程度大于90％。