[发明专利]一组生物标志物的测定方法

摘要

本发明公开了一组生物标志物的测定方法，包括以下步骤：（1）提取与净化；（2）标准工作溶液的配制；将空白样品按上述步骤（1）处理，用该空白样品基质溶液在 2～100 µg/L 范围内，配制至少三个浓度的生物标志物系列浓度标准工作液；（3）液相色谱- 串联质谱法（LC-MS/MS）测定。本发明利用分散固相萃取技术，建立了简便、快速并能有效避免样品中基质干扰的样品前处理方法，将此前处理方法结合HPLC-MS/MS 应用于动物组织及尿液中生物标志物的含量的定性确证和定量检测，方法回收率在74.2%～106.2%之间，平均相对标准偏差（RSD）为6.4%～13.0%，检出限为20.0 μg/kg, 定量限为50.0 μg/kg，具有操作简便、快速、准确、灵敏度高及重复性好的优点。

主权项

一组生物标志物的测定方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)提取与净化样品制备动物肉、动物肝样品经均质制样机充分粉碎，‑20℃避光保存；动物尿样品冰箱中‑20℃避光保存，样品使用前避光解冻：a)动物肉样品：称取样品2.00±0.01g，加基质分散固相萃取剂研磨至色泽均一，转移至50mL聚丙烯离心管中，准确加入10mL提取液和10μL抗氧剂溶液，涡旋10s后用细胞破碎仪超声提取5min，8000r/min离心5min，将上清液转移至另一洁净聚丙烯离心管中；残渣加入5mL提取液，重复提取一次，合并上清液，将合并后的上清液4℃10000r/min离心5min，所得上清液于40℃下氮气吹至近干；用乙腈水(1:9)定容至1mL，定溶液涡旋后转移至2mLEP管中，4℃12000r/min离心10min，吸取上层清液至棕色进样小瓶，HPLC‑MS/MS分析；b)肝脏样品：称取样品2.00±0.01g，加基质分散固相萃取剂研磨至色泽均一，转移至50mL聚丙烯离心管中，准确加入10mL提取液和10μL抗氧剂溶液，涡旋10s后用细胞破碎仪超声提取5min，8000r/min离心5min，将上清液转移至另一洁净聚丙烯离心管中；残渣加入5mL提取液，重复提取一次，合并上清液，将合并后的上清液4℃10000r/min离心5min，所得上清液于40℃下氮气浓缩至2mL左右，加入5×2mL乙腈饱和正己烷脱脂2次，离心，将弃去正己烷后的提取液继续40℃下氮气浓缩至近干；用乙腈：水(1:9)定容至1mL，涡旋后转移至2mL EP管中，4℃12000r/min离心10min，吸取上层清液至棕色进样小瓶，HPLC‑MS/MS进样分析；c)尿液样品：用移液枪取1.0mL动物尿样品于50mL聚丙烯离心管中，用甲酸铵缓冲液调节至中性，加入10μL抗氧剂和1mL甲醇，涡旋30s后8000r/min离心5min，转出上清液，加5mL正己烷脱脂2次后，加载至事先用甲醇和水活化好的HLB小柱，接取流出样液，4℃12000r/min离心10min，吸取上清液进棕色进样小瓶，HPLC‑MS/MS分析；(2)标准工作溶液的配制将空白样品按上述步骤(1)处理，用该空白样品基质溶液在2～100μg/L范围内，配制至少三个浓度的生物标志物系列浓度标准工作液；(3)液相色谱‑串联质谱法(LC‑MS/MS)测定将步骤(2)中的各浓度梯度的标准工作液进行LC‑MS/MS测定，以标准工作液的色谱峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准工作曲线；在相同条件下将步骤(1)中净化后的样品液注入LC‑MS/MS进行测定，测得样品液中生物标志物的色谱峰面积，代入标准曲线，得到样品液中生物标志物含量，然后根据样品液所代表试样的质量计算得到样品中生物标志物含量。