[发明专利]基于上转换发光技术和免疫层析技术对氯霉素定量检测方法

摘要

基于上转换发光技术和免疫层析技术对氯霉素定量检测方法，属于纳米生物标记领域、免疫学领域以及光学检测领域。主要基于以下方面：将200nm-300nm的上转换荧光纳米颗粒进行羧基化修饰，使之成为水溶性好，分散性高且易于与生物分子偶联的标记物；将样品垫、上转换标记物处理过的结合垫、抗原抗体点样过的硝酸纤维素膜(NC膜)和吸水纸通过粘性底衬结合起来，抗原为氯霉素-BSA做检测线(T)，抗体为羊抗鼠抗体做质控线(C)，且相距0.5cm。用切条机将组装好的试纸切成长6cm，宽4mm的试纸条，装备成壳，建立免疫层析试纸；将不同浓度梯度的氯霉素标准抗原加于试纸壳中的样品垫里，经10-15min静置后，放于上转换检测器里进行检测。本发明制备工艺和操作简单，不需要复杂的仪器设备就能完成，既快速又灵敏，对准确定量检测食品中氯霉素含量有重要意义。

主权项

一种基于上转换免疫层析技术对食品中氯霉素含量进行检测的方法，其特征在于，以上转换标记物为检测分子，以试纸为固相载体，以激光检测器为检测手段，具体包括以下步骤:(1)采用反相微乳液法和表面接枝法对上转换纳米材料进行二氧化硅包覆后嫁接多羧基配体：表面活性剂聚氧代乙烯壬基苯基醚(IGEPALCO520)加入到环己烷中，表面活性剂的浓度0.01g/ml‑0.1g/ml，超声分散成透明均相溶液，称取上转换纳米颗粒加入到上述表面活性剂的环己烷溶液中，不断超声搅拌形成透明溶液，将百分含量25％‑28％氨水溶液加入到上述反应体系里，当溶液出现少许乳白色胶体时，超声并不断搅拌使之再次形成透明均相溶液，最后加入正硅酸乙酯，氨水和正硅酸乙酯的体积比为4：1；将反应器置于磁力搅拌器上，室温搅拌12‑18h；当溶液由透明转为淡白色时，加入少许甲醇沉淀颗粒直至沉淀完全；采用差速离心法，离心分离去上清后得到核壳结构的纳米颗粒；量取体积百分含量50％‑70％乙醇水溶液，加入醋酸使溶液酸化，用上述酸化的乙醇水溶液将核壳结构的纳米颗粒重悬，使之成为乳白色溶液，往反应体系里加入的N‑(丙基三甲氧基硅烷)‑乙二胺‑三乙酸钠，边超声边搅拌，室温反应4h‑24h；离心分离，沉淀用无水乙醇或去离子水洗1‑3遍，即羧基修饰上转换纳米颗粒，其中乙醇水溶液：醋酸：N‑(丙基三甲氧基硅烷)‑乙二胺‑三乙酸钠的用量关系为120ml：(10ul‑100ul)：(25ul‑1ml)；(2)采用活化反应、偶联反应、封闭反应对羧基修饰上转换纳米颗粒进行偶联：活化反应：将步骤(1)离心所得到的羧基修饰上转换纳米颗粒用2‑(N‑吗啡啉)乙磺酸吐温‑20缓冲液(MEST)配制为1mg/ml的溶液，其中2‑(N‑吗啡啉)乙磺酸吐温‑20缓冲液(MEST)中2‑(N‑吗啡啉)乙磺酸水溶液与吐温‑20的体积比20:1，2‑(N‑吗啡啉)乙磺酸水溶液的浓度为0.01mol/L，离心数分钟，弃上清得到固体物质；将含有EDC和NHS的MEST加入到上述固体物质中形成MEST反应液中，其中EDC和NHS的质量比为2:1，EDC在MEST中的含量分别为1.2mg和0.6mg，室温避光反应30min‑1h，(一般EDC和NHS需现配现用)；偶联反应：将活化反应后的体系离心数分钟，沉淀用磷酸盐吐温‑20缓冲液(PBST)洗涤，磷酸盐吐温‑20缓冲液(PBST)中吐温‑20的体积百分含量为0.05％‑0.1％，磷酸盐水溶液的浓度为0.01mol/L，在除尽游离的EDC和NHS后得到活化的羧基修饰上转换纳米颗粒，用磷酸盐吐温‑20缓冲液(PBST)配制1mg/ml氯霉素单克隆抗体溶液，与活化的羧基修饰上转换纳米颗粒发生反应，涡旋并超声数秒，偶联反应数小时；封闭反应：将上述偶联反应后的体系离心弃上清，沉淀用PBST洗涤，除去未偶联的氯霉素单克隆抗体，用牛血清白蛋白BSA室温封闭反应30min‑1h，离心，沉淀用磷酸盐吐温‑20缓冲液(PBST)重悬，4℃保存；(3)配制层析液，其中吐温‑20体积分数0.05％‑1％，BSA质量浓度0.1％‑1％和蔗糖质量浓度1％‑2％，溶剂选用0.01mol/l‑0.03mol/l的磷酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲液PH为7.0‑7.4，取步骤(2)封闭反应后的悬浮液，离心去上清，沉淀用上述层析液重悬后，均匀涂抹在玻璃纤维纸上的结合垫区域，37℃干燥过夜，得到标记物处理过的玻纤纸结合垫；用PH为7.0‑7.4、摩尔浓度为0.03mol/l的磷酸盐缓冲液分别配制1mg/ml的氯霉素‑BSA溶液、2mg/ml的羊抗鼠IgG溶液，用点样仪分别将氯霉素‑BSA溶液和羊抗鼠IgG溶液均匀地在硝酸纤维膜(NC膜)上平行划线，其中氯霉素‑BSA为试纸的检测线(为T)，羊抗鼠IgG为质控线(为C)，将NC膜置于37℃下干燥过夜；将上述处理过的NC膜粘于粘性底衬的中间部分，然后将标记物处理过的玻纤纸结合垫搭接粘于NC膜的上方，试纸的检测线相比质控线更接近标记物处理过的玻纤纸结合垫；未做处理的玻纤纸作为样品垫搭接粘于标记物处理过的玻纤纸结合垫的上方；最后将吸水纸搭接粘于NC膜的下方，上述沿粘性底衬平面依次从上而下按顺序为玻纤纸样品垫、玻纤纸标记物结合垫、NC膜和吸水纸，相邻量不同物质之间为搭接；用步骤(3)配制的层析液将1mg/ml氯霉素按100‑10000倍稀释成不同浓度梯度的标准液，用不含有氯霉素层析液作为阴性对照，取50‑100ul的100‑10000倍稀释的氯霉素标准液和不含有氯霉素的阴性对照滴加在试纸的样品垫中进行层析，待NC膜完全被层析液湿润后，室温静置10‑15min检测；采用上转换激光检测系统和电脑建立荧光强度和浓度的关系，其中上转换激光检测系统分为红外光激发装置和荧光接受装置，红外光经准直透镜和聚焦透镜会聚到硝酸纤维膜(NC膜)的检测线和质控线处进行反射，反射光经光谱仪接收光谱，然后通过电脑建立荧光强度和浓度的关系；将待测的氯霉素溶液采用上述同样的方法检测其荧光强度，结合荧光强度和浓度的关系得知待测氯霉素溶液的浓度。