[发明专利]一种两轮信号耦合编码的DNA连接测序方法

摘要

本发明公开了一种两轮信号耦合编码的DNA连接测序方法，该方法通过优化标记物的编码方式，从而实现在不增加标记物的前提下，利用简单的信号编码关系建立两轮信号之间的耦合关联，一轮测序反应中测定超过一位碱基信息，从而形成快速、准确、低成本和高通量的DNA序列测定方法。本发明方法通过对两轮测序信号的耦合，测定了3位碱基的信息，大大提高了测序速度，当连接效率一定时，测序读长增加了50％，同时测序成本也有一定幅度的降低，并且两轮测序信号之间形成了相互校验的作用，也有利于提升测序结果的准确性。

主权项

一种两轮信号耦合编码的DNA连接测序方法，其特征在于：具体包括如下步骤：步骤1，制备一套耦合编码的DNA测序探针：DNA测序探针共16种，分别对应两位测序碱基的16种组合形式；用四种标记物中的1种标记物或任意2种标记物进行组合共构成10种标记状态，选用10种标记状态中的8种对16种测序探针进行标记，每种标记状态对应两种测序探针；步骤2，两轮测序信号耦合确定三位碱基序列信息：采用步骤1得到的一套测序探针，先进行第一轮测序反应，通过对标记物信号的检测，可以判断待测位置所包含的两位待测碱基与该标记物状态对应两种测序碱基中的一种互补配对；进行第二轮测序反应，第二轮测序反应是测定与第一轮测序反应所测的待测碱基存在一位重叠的两位碱基，同样可以确定这两位待测碱基与所检测到的标记物状态对应两种测序碱基中的一种互补配对；对两轮测序反应分别确定的两种碱基组合进行全部可能性的判读，即可得到唯一确定的三位碱基的序列信息；步骤3，连接测序：选取一条测序引物与待测的DNA模板依据碱基互补配对原理进行杂交；向总的反应体系中加入步骤1的一套测序探针和DNA连接酶及其反应体系，进行DNA连接反应；完成DNA连接反应后，检测四种标记物的信号状态，确定被测DNA模板上对应位置两位碱基的两种可能信息；完成对标记物信号的检测后，移除DNA测序探针上的标记物；重复连接‑信号判读‑标记物移除操作直至达到或超出待测DNA模板待测区域末端；该测序引物与待测DNA模板变性分离，选取第二条测序引物，重复杂交及循环连接‑信号判读‑标记物移除操作，直至全部未知DNA模板的待测区域的全部序列得以检测；利用测序结果中每相邻两轮测序信号耦合分别确定不同位置的三位碱基，最终确定DNA模板待测区域的全部序列信息。