[发明专利]一种从冷沉淀提取凝血因子Ⅷ的废料中提取人纤维蛋白原的制备工艺

摘要

本发明公开了一种从冷沉淀提取凝血因子Ⅷ的废料中提取人纤维蛋白原的制备工艺，其特征在于包括冷沉淀溶解、2%氢氧化铝凝胶吸附、调节离子强度、串联过滤、S/D病毒灭活、离子交换层析、EDTA除Ca2+、甘氨酸沉淀、第一次低温乙醇沉淀、AT‑Ⅲ抑制凝血酶、第二次低温乙醇沉淀、纳米膜过滤以及干热灭活。本发明为了确保安全性，除了S/D及干热灭活外，新增纳米膜过滤除病毒；新增AT‑Ⅲ灭活凝血酶及EDTA除Ca2+工艺，有效阻止在生产过程中纤维蛋白原激活成纤维蛋白；用甘氨酸沉淀去除制品中的纤维蛋白单体和多聚体，以获得高纯度的人纤维蛋白原；所得制剂产品安全可靠，复溶时间短，满足临床上救急之需，同时间接节约稀缺血浆资源具有重要意义。

主权项

一种从冷沉淀提取凝血因子Ⅷ的废料中提取人纤维蛋白原的制备工艺，其特征在于，制备工艺如下：（1）、收集冷沉淀；（2）、将步骤（1）的冷沉淀加入3IU/ml肝素钠溶液中，搅拌至冷沉淀完全溶解，循环水的温度控制在20～28℃；开始离心，收集上清液，称重；（3）、将步骤（2）的制得物上清液用0.5mol/L HCL调节PH至6.6～7.2；加入2%氢氧化铝凝胶，搅拌；开始离心，收集上清液，称重；（4）、按“调节离子强度缓冲液W=上清液重量/19”计算，称取计算量的调节离子强度缓冲液至步骤（3）的制得物上清液中；调节上清液PH至6.8～7.5；用调节蛋白浓度缓冲液调节蛋白浓度，蛋白浓度最终被调节至浓度值为不大于15.0g/L；用1.0um的滤芯和0.45um的滤芯串联过滤，收集过滤液，称重；（5）、按步骤（4）的制得物过滤液体积的1/10加入S/D溶液，搅拌均匀，温度控制在24～26℃，连续保温6小时；0.45um滤芯过滤；过滤液用100KD超滤膜浓缩至蛋白浓度1.5%，然后用蛋白液重量的2倍以上洗涤缓冲液恒体积超滤，得超滤液，称重；（6）、将步骤（5）的制得物超滤液用离子交换柱进行层析纯化，用洗涤液洗涤柱子直至成基线，用洗脱液洗脱，收集洗脱液，洗脱液经超滤、透析、过滤，用于凝血因子VIII的生产；再从冷沉淀提取凝血因子Ⅷ的废料即收集经层析柱流出来的液体中提取人纤维蛋白原；经层析柱流出来的液体称量；加入适量0.01mol/L 乙二胺四乙酸（EDTA）液体溶解，轻微搅拌10小时，温度控制在2～4℃，PH控制在7.1～7.3；离心，收集上清液；（7）、在步骤（6）收集的液体中，添加适量甘氨酸，使终甘氨酸浓度为6%，温度控制在‑1～‑3℃，搅拌离心，收集沉淀；沉淀加入10倍重量份的枸橼酸钠、氯化钠缓冲液中，搅拌溶解30min进行压缩过滤，收集滤液，将滤液温度降温至0～1℃；加‑15℃以下的95%乙醇，使乙醇终浓度V/V为8％，温度控制在‑1～‑3℃，加完乙醇后pH值为6.95～7.15；搅拌30分钟；离心，离心过程中出液温度控制在‑1～‑3℃，收集离心后沉淀，称重；（8）、量取10倍重量份步骤（7）所述的枸橼酸钠、氯化钠缓冲液，加入AT‑Ⅲ灭活凝血酶使得溶液最终AT‑Ⅲ效价值为1mU/ml，将步骤（7）的制得物沉淀加入溶解液中，搅拌溶解30min进行压缩过滤，收集滤液，将滤液温度降温至0～1℃；加‑15℃以下的95%乙醇，使乙醇终浓度V/V为8％，温度控制在‑1～‑3℃，加完乙醇后pH值为6.95～7.15；搅拌30分钟；离心，离心过程中出液温度控制在‑1～‑3℃，收集离心后沉淀，称重；（9）、将步骤（8）的制得物沉淀加入5倍重量份的枸橼酸钠、氯化钠、盐酸精氨酸缓冲液中，搅拌溶解进行压缩过滤；收集滤液，计量；稀配，调整蛋白含量为2.0～3.0℅，调整pH为7.0±0.1；35nm纳米膜过滤，收集滤液；（10）、将步骤（9）的制得物滤液经0.2μm除菌滤芯过滤分装；分装好的制品传入冻干柜进行冷冻干燥；出柜扎盖；99～100℃、30分钟干热病毒灭活；送检，检验合格后包装、入库；所述百分数除有限定之外，其余为质量百分数。