[发明专利]新型功能性磁感应性神经支架进行复合种子细胞修复方法

摘要

本发明公开了新型功能性磁感应性神经支架进行复合种子细胞修复方法。本发明的制备方法包括如下步骤：(1)制备多微孔性磁性神经支架；(2)种子细胞的分离、培养与纯化；(3)种子细胞与磁性神经支架生物学检测。本发明在制备复合种子细胞的新型功能性磁感应性神经支架的过程中，采用一定浓度的磁性纳米微粒，形成具有可磁化的磁性系统，将种子细胞与该磁性支架复合，在外部磁场作用下，不仅可以促进种子细胞的存活和增殖，还能促进神经营养物质的分泌，有效促进受损神经再生。本发明制备的磁性神经支架能够使再生神经通过组织材料内部磁场定向生长，加速神经损伤修复和成髓鞘，进一步提高神经缺损的修复效果。

主权项

新型功能性磁感应性神经支架进行复合种子细胞修复方法，其特征在于按照以下步骤进行：步骤1：制备磁性纳米微粒；分别配制0.1mol/L的Fe³⁺及Fe²⁺溶液，在通氮气条件下，按照Fe³⁺:Fe²⁺摩尔比为2:1混合，机械搅拌4h，向混合溶液中滴加1mol/L的NaOH溶液，直至混合溶液pH＝9.5，水浴加热2h后静置5h，移去上层清液，将生成的粒子减压抽滤，用蒸馏水及无水乙醇反复进行洗涤，洗去粒子表面的杂质离子，将粒子在50℃下真空干燥，研磨过筛，得到磁性纳米微粒；步骤2：制备磁性凝胶状混浊液；将β‑甘油磷酸钠溶液滴定壳聚糖混浊液，使混合液最终的pH＝7.0～7.2，然后将所得的混浊液在预冷好的冷冻干燥机中冻干24h，得到壳聚糖/β‑甘油磷酸钠混合物粉末，然后将磁性纳米微粒与壳聚糖/β‑甘油磷酸钠混合物粉末混合，加入去离子水，4℃下，15000rpm，搅拌120min，制得磁性混浊液，4℃下将磁性混浊液抽真空24h，制得磁性凝胶状混浊液；步骤3：制备磁性神经支架；将磁性凝胶状混浊液倒入管状的磁性神经支架模具中，以小铁夹固定成形模具的两端，在微型调速仪下，以垂钓的方式将成形模具顺轴向以2×10^‑5m/s的速度缓慢浸入液氮中，对注入磁性神经支架模具中的磁性凝胶状混浊液进行冷淋固形处理，待磁性神经支架模具完全浸入液氮后，继续在液氮中保留10h～14h，将磁性神经支架模具连同内部注入的磁性凝胶状混浊液一同转入‑80℃的冰箱中冷藏，冷藏24h后取出，迅速去除磁性神经支架模具两端的铁夹和铜管，之后放置于预冷好的冷冻干燥机中冻干36h～40h，其中冷冻干燥机设置的预冷参数为：‑60℃、100mtorr；将冻干处理后的磁性神经支架模具放置于真空状态下并升温至0℃，保持6h，之后再升温至24℃，保持60min，解除真空状态，升至常温，得到磁性神经支架，最后将磁性神经支架从磁性神经支架模具中取出；步骤4：交联处理；将磁性神经支架放入京尼平和无水乙醇混合溶液中进行交联处理，交联时间为46h～50h，每克磁性神经支架加入20ml京尼平和无水乙醇混合溶液，交联处理后将磁性神经支架用去离子水和质量百分浓度为95％的酒精交替清洗30min，然后置于常温下干燥一周，最后用⁶⁰Co照射磁性神经支架，进行消毒处理，得到消毒后的磁性神经支架；步骤5：种子细胞的分离、纯化与培养；新生SD大鼠5只，分离坐骨神经，剪碎神经组织，消化离心后，利用差速贴壁法纯化培养雪旺细胞，将第三代的雪旺细胞进行S‑100与DAPI免疫细胞荧光双重染色鉴定，确定种子细胞浓度不小于95％；步骤6：种子细胞复合在磁性神经支架后的修复；消毒后的磁性神经支架剪成长5mm、直径2mm的圆柱体，放入96孔板中，将种子细胞与磁性神经支架复合24h后，磁场干预处理，进行细胞修复。