[发明专利]FcRn介导的抗细粒棘球蚴靶向黏膜疫苗载体的构建方法

摘要

本发明公开了一种FcRn介导的抗细粒棘球蚴靶向黏膜疫苗载体的构建方法，包括如下步骤：(1)目的基因Eg95的扩增(2)小鼠野生型Fc片段(Fc/wFc)和突变型Fc片段(Fc/mFc)的扩增(3)Eg95-Fc/wFc(mFc)的扩增(4)Eg95-Fc/wFc(mFc)融合蛋白在杆状病毒表面的展示(5)Eg95-Fc/wFc(mFc)重组病毒粒子的纯化。

主权项

一种FcRn介导的抗细粒棘球蚴靶向黏膜疫苗载体的构建方法，其特征在于包括如下步骤：(1)目的基因Eg95的扩增合成引物P1：3’‑GCTCTCGAGATGGCATTCCAGTTA‑5’,P2：3’‑GAAGAATTCAGTAAGGACAACCAC‑5’；处死细粒棘球蚴感染小鼠，无菌分离Eg包囊，抽提囊液，分离原头节，按RNAeasy Mini试剂盒提取总RNA，然后以总RNA为模板，用Oligo(dT)₁₈随机引物进行反转录，再以P1,P2为引物进行PCR扩增，经1.0％琼脂糖凝胶电泳分离大小约为468bp特异性条带，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1；(2)小鼠野生型Fc片段(Fc/wFc)和突变型Fc片段(Fc/mFc)的扩增合成引物P3：3’‑GAGCCCAGAGGGCCCACAATCAAGC‑5’,P4：3’‑TTTACCCGGAGTCCGGGAGAAG‑5’，用于扩增Fc片段，然后通过点突变将Glu318、Lys320、Lys322突变为Ala，将扩增出的片段命名为Fc/wFc，其核苷酸序列为SEQ ID NO.2；进一步通过点突变的方式，以Fc/wFc为模板，将His310、His433突变为Ala残基，将扩增出的片段命名为Fc/mFc,其核苷酸序列为SEQ ID NO.3；(3)Eg95‑Fc/wFc(mFc)的扩增在Eg95下游引物的5′端和Fc/wFc或Fc/mFc基因上游引物的5′端引入14个柔性氨基酸linker(GSGGGGSGGGGSGS)，然后通过长片段无模板扩增法获得融合片段，经1.0％琼脂糖凝胶电泳鉴定和序列测定正确的片段命名为Eg95‑Fc/wFc和Eg95‑Fc/mFc，Eg95‑wFc融合基因序列为SEQ ID NO.4；Eg95‑mFc融合基因序列为SEQ ID NO.5；(4)Eg95‑Fc/wFc(mFc)融合蛋白在杆状病毒表面的展示将测序后正确的融合基因的PCR产物经XhoI和PstI双酶切后回收并纯化，然后定向插入与同样双酶切的转座质粒pBacSC的MCS中，将重组质粒转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取单菌落，提取质粒，进行序列测定鉴定；将鉴定正确的重组质粒转化至含有杆状病毒DNA的大肠杆菌感受态细胞DH10Bac中，经过卡那霉素、庆大霉素和四环素三种抗性LB平板筛选，挑取白斑菌落，提取重组杆状病毒DNA；将重组杆状病毒DNA利用脂质体2000转染Sf‑9细胞；待细胞出现病变或大量荧光出现后，收集培养上清作为原毒种，分小管贮存于‑80℃冰箱；悬浮培养昆虫细胞，待细胞浓度达到1×10⁶个/ml，以1MOI的重组杆状病毒量感染昆虫细胞，利用病毒在昆虫细胞中复制达到病毒增殖，感染3～4d后离心除去细胞及细胞碎片，收集上清液，便完成病毒量扩增；(5)Eg95‑Fc/wFc(mFc)重组病毒粒子的纯化通过病毒感染Sf‑9细胞完成病毒量的扩增后，收集病毒感染3～4d的细胞，经反复冻融、离心收集上清液，然后通过超速离心和蔗糖密度梯度离心获得纯化的重组病毒粒子，用BCA法测重组蛋白浓度，置‑80℃保存备用。