[发明专利]一种具有抗氧化活性的类球红细菌提取液及其制备方法

摘要

一种具有抗氧化活性的类球红细菌提取液及其制备方法，属于类球红细菌提取液技术领域。提取液中包括类胡萝卜素或辅酶Q10或超氧化物歧化酶(SOD)包括以下步骤：菌种活化、类球红细菌发酵、类球红细菌离心分离、类球红细菌提取液制备。本发明制备的类球红细菌提取液具有开创性的意义。

主权项

一种具有抗氧化活性的类球红细菌辅酶Q10提取液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)菌种活化配制固体培养基，质量百分含量：葡萄糖1‑5％，胰蛋白胨0.5‑5％，酵母粉0.5‑5％，氯化钠0.5‑2％，琼脂1.5‑2％，pH＝7‑9；并将其与培养皿置于121℃高压蒸汽灭菌15‑30min；然后无菌条件下，倒平板，挑类球红细菌进行平板划线；将平板置于28‑37℃培养，2‑7d；配置斜面培养基，斜面培养基与上述固体培养基一样，并于121℃高压蒸汽灭菌15‑30min；无菌条件下，挑取上述平板上的类球红细菌单菌落进行斜面接种；然后将斜面置于28‑37℃培养，2‑7d；(2)类球红细菌发酵①种子培养：种子培养基液体，质量百分含量：葡萄糖1‑5％，胰蛋白胨0.5‑5％，酵母粉0.5‑5％，氯化钠0.5‑2％，pH＝7‑8；并于121℃高压蒸汽灭菌15‑30min；用无菌接种环从步骤(1)活化后的类球红细菌斜面中取菌体一环，接种到盛有种子培养基液体的三角瓶中，于28‑37℃，150‑200r/min摇床振荡培养12‑36h，得到液体种子；然后无菌条件下，将得到的液体种子按5‑10％的接种量接种于灭菌的种子培养基中，于28‑37℃，150‑200r/min摇床振荡培养12‑42h，得到活化的液体种子；②发酵：液体发酵培养基，质量百分含量：葡萄糖0.1‑10％，牛肉膏0.05‑5％，磷酸氢二钾0.05‑0.15％，磷酸二氢钾0.03‑0.10％，无水氯化钙0.002‑0.02％，EDTA 0.001‑0.01％，生长因子溶液0.5‑2％，微量元素溶液0.5‑2％，pH＝7‑8；微量元素溶液配方：硫酸锰0.08‑0.3％；并于121℃高压蒸汽灭菌15‑30min，其中生长因子溶液配方：维生素B1 0.05‑0.2％，烟酰胺(VPP)0.05‑0.2％，生物素0.001‑0.002％，对氨基苯甲酸0.05‑0.2％，生长因子过滤除菌；按照3‑15％的接种量将①摇床活化的液体种子接种到盛有液体发酵培养基的三角瓶中，于28‑37℃，100‑270r/min摇床振荡培养24‑60h，得类球红细菌发酵液；(3)类球红细菌离心分离取步骤(2)类球红细菌发酵液于6000‑20000rpm离心5‑30min，收集菌体，弃上清，再用蒸馏水清洗菌体1‑3次，分别于6000‑20000rpm离心5‑30min，收集菌体，即得类球红细菌湿菌体；(4)制备类球红细菌提取液研磨法：取菌体加石英砂研磨10‑30min，研磨成匀浆，按菌体/甲醇‑氯仿溶液质量比为1：5‑1：35添加甲醇‑氯仿溶液震荡20‑60min，甲醇‑氯仿溶液中甲醇、氯仿体积比为1︰2，其中菌体：石英砂的质量比(0.5‑2)：(2‑5)；或超声波法：取菌体按菌体/甲醇‑氯仿溶液质量比为1：5‑1：35添加甲醇‑氯仿溶液，其中甲醇‑氯仿体积比为1︰2，震荡混匀后用超声波粉碎仪进行破壁处理：振幅20‑60％、工作/间隔时间0.5‑2min/0.5‑2min，冰浴超声波总时间5‑30min；最后震荡20‑60min；或酶法辅助超声波法：采用溶菌酶和磷酸缓冲液对菌体进行酶解，溶菌酶添加量为0.05‑1mg溶菌酶/g菌体，按菌体/磷酸缓冲液的质量比1∶5‑1∶35，酶解温度25‑50℃，酶解pH值5‑9，酶解时间30‑180min；酶解后于6000‑20000rpm离心5‑30min，收集菌体；按菌体/甲醇‑氯仿溶液质量比为1∶5‑1∶35添加甲醇‑氯仿溶液悬浮菌体，其中甲醇‑氯仿体积比为1︰2；然后进行冰浴超声波处理：振幅20‑60％、工作/间隔时间0.5‑2min/0.5‑2min，冰浴超声波总时间10‑30min；最后震荡20‑60min；或纳米研磨法：将类球红细菌湿菌体放入高能纳米冲击磨罐中，于1‑8℃下震磨5‑12h，然后按菌体/甲醇‑氯仿溶液质量比1∶5‑1∶35加入甲醇‑氯仿溶液，其中甲醇‑氯仿体积比为1︰2，震荡20‑60min；辅酶Q10提取液收集采用不同破壁提取方法提取菌体中辅酶Q10后，于6000‑20000rpm离心10‑60min，取上清液，用旋转蒸发仪于20–55℃进行旋转蒸法，将上清液浓缩干，按菌体/无水乙醇质量比为1∶5‑1∶35添加无水乙醇溶解样品，得到辅酶Q10提取液。