[发明专利]一种百菌清酶联免疫检测方法

摘要

一种百菌清酶联免疫检测方法，属于酶联免疫检测(ELISA)技术领域。本发明公开了一种百菌清单克隆抗体酶联免疫检测方法，利用合成的百菌清免疫原免疫BALB/c小鼠得到单克隆抗体，以百菌清为标准品，以百菌清半抗原与OVA的偶联物作为包被原，建立了百菌清的间接ELISA方法，为百菌清的残留检测提供了快速高效的检测方法，最低检测限为0.06ng/mL、半数抑制量(IC50)为0.3ng/mL。免疫反应的高特异性和亲和性使ELISA检测百菌清具有极高的选择性和灵敏度。

主权项

一种百菌清酶联免疫检测方法，其特征在于利用合成的百菌清免疫原免疫BALB/c小鼠得到单克隆抗体，以百菌清为标准品，以百菌清半抗原与 OVA 的偶联物作为包被原，建立百菌清的间接竞争酶联免疫检测方法，步骤如下 ：（1）以 0.05M 的碳酸盐缓冲溶液稀释包被原，从2µg/mL开始倍比稀释，稀释4个浓度，稀释后加入酶标板中，每孔 100μL；4℃孵育过夜，封闭、洗涤；（2） 将4个浓度梯度的百菌清标准品加入酶标板中，每孔50μL；同时加入以抗体稀释液稀释为 1︰1000～1︰8000 的单克隆抗体，每孔50μL；37℃竞争 30min，再用含吐温的磷酸盐缓冲液 PBST 洗涤 3次，加入1:3000稀释的HRP‑羊抗鼠IgG，100μL /孔，37℃作用0.5h，再用 PBST 洗涤 3次；所述 PBST 溶液：含 0.05％ Tween‑20 的 0.01M PBS 溶液；所述封闭液：含 0.1％明胶的 pH 9.6、0.05M 碳酸盐缓冲溶液；所述抗体稀释液：含 0.1％明胶的 PBST 溶液；（3）配置显色液A液：配方为每100mL 超纯水中加入0.933g柠檬酸，3.68g Na₂HPO₄·12H₂O，18μL 30％H₂O₂；B 液：配方为 60mg 四甲基联苯胺溶于 100mL 乙二醇中；使用前将 A 液与 B 液以 5︰1 体积比混合；（4） 加入显色液 100μL，37℃显色 15min；加入终止液 2M 硫酸溶液100μL/孔，酶标仪 450nm 测吸光值 OD，根据不同浓度百菌清标准液的吸光值绘制百菌清浓度‑吸光值标准曲线；（5）样品检测：将待测样品按步骤（1）～（4）进行操作，所得酶标仪 450nm 测吸光值 OD与所作标准曲线对比算出待测样品中的百菌清含量。