[发明专利]一种大规模高密度生产猪圆环病毒2型抗原的方法

摘要

本发明涉及一种大规模高密度生产猪圆环病毒2型抗原的方法。本发明使用生物反应器微载体悬浮培养工艺代替现有转瓶培养工艺生产猪圆环病毒2型抗原，该方法可以大量降低生产成本和提高产量，相比转瓶工艺单位抗原成本降低80％～90％，生产周期减少7天，产量提高3～10倍；因为其可以多次收获抗原，因而较传统反应器培养工艺单位抗原成本降低40％～50％，产量提高3～5倍，此发明生产的抗原无血清残留，生产的疫苗安全性更高，同时制品的批间差异小，质量稳定易于控制，可明显提高制品的产量及质量。

主权项

一种大规模高密度生产猪圆环病毒2型抗原的方法，该方法包括如下步骤：(1)种子细胞的制备将无菌生理盐水预热处理，使用预热后的生理盐水洗涤长满单层的健康克隆细胞PK‑15W作为种细胞，加入20～40ml胰酶进行消化，消化期间，时刻观察细胞层变化，待细胞层呈白色雾状并部分脱落时，加入含有伴刀豆球蛋白A和D‑氨基葡萄糖的有血清低糖DMEM的细胞生长液，种子细胞终止消化，迅速摇动转瓶，使壁上细胞脱落，反复吹打分散细胞后，按照1:3至1:5的传代比例分瓶；(2)制苗细胞的制备根据最终培养体积称取Cytodex‑1微载体，使其终浓度为5～10g/L，用PBS进行浸泡清洗，灭菌后，在搅拌式生物反应器中使用细胞生长液进行平衡，备用；选取生长状态良好的种子细胞接种生物反应器，接种密度为1～5×10⁵个/ml；(3)接毒随后，以最终培养体积的3％～8％接种PCV2种毒；接种后，设定反应器控制条件为：pH7.0～7.4，DO为20％～80％，搅拌速度为80～120r/min；(4)病毒的收获和含量测定待细胞在前述条件下，细胞生长液中培养48～72h后静置，排出上清，加入含有伴刀豆蛋白A和水解酪蛋白的无血清低糖DMEM细胞维持液，调整反应器控制条件为：pH7.0～7.4，DO为20％～80％，搅拌速度为100r/min～180r/min，继续维持48～72h后静置，进行第一次上清收获，观察细胞状态，如细胞状态良好则补加与收获上清等量的新鲜细胞维持液，在pH7.0～7.4，DO为20％～80％，搅拌速度为100r/min～180r/min的条件下继续培养48～72h后静置，进行第二次上清收获，重复此过程直至微载体上的细胞全部脱落，结束整个培养过程，收获上清后，将微载体进行回收处理，并将收获的抗原反复冻融3次后作为半成品，测定其病毒含量。