[发明专利]人乳头瘤病毒8E7蛋白表达及应用

摘要

本发明提供一种人类乳头瘤病毒HPV-8E7蛋白的表达纯化方法，通过设计HPV-8E7的扩增引物，并从HPV-8E7质粒中有效扩增出这个基因，插入到载体pGEX-4T2和pEGFP-C1中，获得重组载体，转染，收集上清与4B磁珠结合，再用凝血酶切除GST标签，获取HPV-8E7蛋白，行多点免疫，获得纯化的多克隆抗体。本发明增加了该蛋白原核表达时的可溶性，从而降低下游大规模生产成本以及分离纯化难度，在提高表达量的同时也有利于分离纯化，使该蛋白在工业化放大生产时降低难度，减少成本，并经纯化、免疫，得到高特异性、高效价比的多克隆抗体，能大大提高检测的准确率，为进一步研究治疗宫颈癌等疾病奠定基础。

主权项

人乳头瘤病毒8E7蛋白表达及纯化方法，其特征在于，通过以下步骤实现：（1）HPV‑8E7基因的调取及扩增：设计HPV‑8E7的扩增引物，并从HPV‑8E7质粒中有效扩增出这个基因，其中用于扩增用于原核表达的HPV‑8E7序列的上游引物序列SEQ ID NO.1：5’‑GGATCCATGATTGGTAAAGAGGTCACTGT‑3’，划线部分为EcoRⅠ酶切位点，下游引物序列SEQ ID NO.2：5’‑GAATTCTTATGATCCGCCATGTTTGCA‑3’，划线部分为BamHⅠ酶切位点；用于扩增用于真核表达的HPV‑8E7序列的上游引物序列SEQ ID NO.3：5’‑ GAATTCTATGATTGGTAAAGAGGTCACTGT‑3’， 划线部分为BamHⅠ酶切位点，下游引物序列SEQ ID NO.4：5’‑GGATCCTTATGATCCGCCATGTTTGCA‑3’，划线部分为EcoRⅠ酶切位点；（2）HPV‑8E7基因原核及真核表达载体的构建：将步骤（1）中得到的这两个含不同酶切位点的HPV‑8E7基因序列按照先后顺序插入到载体pGEX‑4T2和pEGFP‑C1中，获得用于后续同源重组的重组载体pGEX‑4T2‑(HPV‑8E7)和pEGFP‑C1‑(HPV‑8E7)；（3）GST‑(HPV‑8E7)融合蛋白的原核表达：将步骤（2）中构建的重组载体pGEX‑4T2‑(HPV‑8E7)转入大肠埃希菌DH5α，优化IPTG浓度、诱导时间和诱导温度；在250‑300w超声功率下，超声时间9秒，间歇时间9秒，总时长约3分钟以破碎细菌，收集上清；（4）GST‑(HPV‑8E7)融合蛋白的纯化及HPV‑8E7蛋白的获得：通过（3）步骤获得的上清与Glutathione‑Sepharose 4B磁珠结合，再用凝血酶切除GST标签，获取HPV‑8E7蛋白，PBS透析过夜获得纯化的HPV‑8E7蛋白。