[发明专利]一种转溶菌酶基因罗非鱼的制备方法

摘要

本发明属于转基因技术领域，具体公开了一种转溶菌酶基因罗非鱼的制备方法。本发明将携带有Hsp70启动子驱动的溶菌酶C3基因的Tgf2 转座子引入到罗非鱼受精卵内，利用转座子的转座特性将Hsp70启动子和溶菌酶C3基因一起整合到罗非鱼的基因组上，得到能够诱导表达罗非鱼溶菌酶C3的罗非鱼新品系。这一技术不仅能提高罗非鱼的免疫力，达到育成具有较强抗病力的罗非鱼新品种，而且还是首次将Tgf2 转座子引入到转基因罗非鱼的构建中，为养殖鱼类导入外源基因开辟了新的方法，具有重要的理论意义和应用价值。

主权项

一种转溶菌酶基因罗非鱼的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：S1.以pTgf2‑Hsp70‑eGFP为出发质粒构建携带罗非鱼Hsp70启动子和奥里亚罗非鱼溶菌酶C3基因的Tgf2 转座子质粒；S2.获取产卵后1小时以内、处于单细胞时期的罗非鱼受精卵，具体方法为将雌性罗非鱼进行室内饲养，控制温度25~30℃，每天14小时的光照，10小时的黑暗，每周投喂二次维生素E；观察雌鱼的繁殖活动，定期检测雌性罗非鱼口中是否含有卵，记下雌性罗非鱼每一次产卵的时间，掌握雌性罗非鱼的产卵周期；对处于产卵期的雌性罗非鱼进行人工挤卵，与挤出的雄性罗非鱼的精液混合获得处于单细胞时期的刚受精的罗非鱼卵；S3.将S1所述的Tgf2 转座子质粒和能够提供转座酶的mRNA一起导入罗非鱼的受精卵中，得转基因F0代罗非鱼；S4.当F0代罗非鱼长至二月龄时，剪取鳍条提DNA，PCR检测，筛选出阳性个体，PCR所用上游引物设计在Hsp70上，下游引物设计在罗非鱼的溶菌酶C3上，能扩增出目的带的个体，即为阳性个体，上游引物和下游引物的序列如SEQ ID NO：3~4所示；待阳性个体饲养至成鱼后与野生罗非鱼交配续代，即得到转基因F1代罗非鱼，再对转基因F1代罗非鱼进行阳性率检测，筛选得到能稳定遗传Hsp70与溶菌酶C 3基因的转基因罗非鱼。