[发明专利]一种DNA-AuNPs纳米网络结构的制备方法及应用

摘要

本发明公开了一种DNA-AuNPs纳米网络结构的制备方法及应用，包括Au NPs的制备、DNA功能化Au NPs的制备和DNA-AuNPs纳米网络结构的层层组装；本发明利用DNA-AuNPs做纳米信标，利用DNA的互补特性形成双链DNA，进而形成纳米网络结构，有利于RuHeX这种电活性物质的吸附；而利用DNA的互补的性能形成DNA-Au NPs的网状结构，为电活性物质的吸附提供了大量的位点，从而实现电化学信号的放大，用于蛋白激酶活性及其抑制剂分析，通过锆离子的配位作用，利于纳米网络结构修饰在电极表面，为活性物质提供了大量的负载位点，极大增强了电化学信号，因此，该生物传感器对激酶活性的最低检测限值达到0.03U/mL，同时稳定性高、线性范围宽。

主权项

一种DNA‑AuNPs纳米网络结构的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：1)Au NPs的制备：100mL0.01％(w/v)HAuCl₄水溶液加热至回流，2.5mL1％(w/v)柠檬酸钠迅速到入三颈烧瓶中，整个反应保持沸腾15min，溶液由无色逐渐变成酒红色为止，即得Au NPs，于4℃保存备用；2)DNA功能化Au NPs的制备：首先DNA经TCEP活化2h防止形成二硫键；将DNA1或DNA2加入到1mL Au NPs中，室温下搅拌24h；充分反应后，在室温下逐滴缓慢加入150μL1M NaCl，于黑暗条件下反应24h；将反应好的溶液以12000rpm的转速离心分离10min，然后重新分散于300mM NaCl溶液中，得DNA1‑AuNPs或DNA2‑AuNPs，悬于50mM Tris‑Hcl缓冲液中备用；将制备好的DNA2‑AuNPs用1μMcDNA处理，即得cDNA‑DNA2‑Au NPs，其中cDNA的序列为5’‑CAGACTACTACAAGCTTTCACAAATCCTAAACG‑3’、DNA1的序列为5’‑P‑GCTTGTAGTAGTCTG‑C6‑SH‑3’，DNA2的序列为5’‑SH‑C6‑CGTTTAGGATTTGTG‑3’；3)DNA‑AuNPs纳米网络结构的层层组装：在金电极进行组装之前，首先将金电极分别用0.3μm和0.05μm的α‑Al₂O₃糊中抛光打磨，并依次在乙醇和去离子水中超声清洗1min，并在0.5M的H₂SO₄溶液中采用三电极系统进行电化学清洗和活化；将处理好的金电极浸泡于0.05M pH为7.4的含有500μM肯普肽的磷酸缓冲液中，并置于室温下反应12h，然后金电极经过大量的磷酸缓冲液和二次水冲洗，干燥，得肯普肽修饰电极；用1mM巯基己烷封闭空白位点，然后将肯普肽修饰电极插入含有20mMMgCl₂溶液、蛋白激酶A和100μM ATP的缓冲液中，在37℃反应1h，得到磷酸化肯普肽修饰电极；将完成磷酸化的肯普肽修饰电极清洗干净，随后分别用0.5mM Zr⁴⁺和6μL纳米信标DNA1‑AuNPs处理该电极，通过Zr⁴⁺与磷酸根的配位作用将纳米信标组装于磷酸化的肯普肽修饰电极；最后，该修饰电极用TBS、二次水润洗和N₂吹干；该电极连续的经过cDNA‑DNA2‑AuNPs和DNA1‑AuNPs处理后，形成DNA‑AuNPs纳米网络结构，层层组装后经TBS处理、润洗，得DNA‑AuNPs纳米电极。