[发明专利]小鼠裸卵的体外成熟培养方法

摘要

本发明公开了小鼠裸卵的体外成熟培养方法，包括以下步骤：（1）裸卵的体外成熟培养；（2）成熟裸卵的孤雌激活；（3）成熟裸卵的体外受精。本发明能够创造一个人工模拟卵母细胞自然发生成熟的环境，使裸卵在体外能够高效成熟发育，并且裸卵体外培养成熟后具备同正常发育的卵母细胞一样能够体外受精和胚胎发育。实践证实，该体系裸卵体外成熟发育效率高，体系成熟稳定，裸卵体外自然受精后胚胎发育质量高，因此，本发明能够极大地促进裸卵在人类生殖健康和现代家畜遗传育种中的应用和推广。简化了通过裸卵获得囊胚的操作，为裸卵作为卵源投入到实际生产提供了便利。

主权项

小鼠裸卵的体外成熟培养方法，其特征在于包括以下步骤：取小鼠卵巢，在显微镜下用注射器针头部，刺破卵巢上卵泡，使卵泡中的卵母细胞释放到含HEPES和10%FBS的TCM199卵母细胞体外操作液中，用捡卵针随机把裸卵体外洗涤后，随机分组用补加含50μM forskolin的卵母细胞成熟培养液In‑Vitro Maturation Media培养3h后，转移裸卵用补加含2.5μM PD166285的卵母细胞成熟培养液In‑Vitro Maturation Media继续体外培养16h；（2）成熟裸卵的孤雌激活取经过成熟培养排出第一极体的裸卵，转移裸卵至含10mM SrCl₂的CZB培养液中激活培养2.5h，然后激活处理的裸卵至G‑1PLUS培养液中进行继续培养，待孤雌激活裸卵发育至8‑细胞胚胎阶段时，转移胚胎至G‑2PLUS培养液中继续培养；所述CZB培养液的组分为：81.62mM氯化钠+4.83mM氯化钾+1.18mM磷酸二氢钾+1.18mM硫酸镁+1.71mM氯化钙+25mM碳酸氢钠+31.3mM乳酸钠+1mM谷氨酰胺+0.1mM EDTA+5mg/ml BSA；（3）成熟裸卵的体外受精取经过成熟培养排出第一极体的裸卵，用受精液洗涤后，转移到HTF受精液滴中，同时转移获能的精子至成熟裸卵的HTF受精液滴中体外共同孵育培养，成熟裸卵同获能精子经过6h的共同孵育培养后，在显微镜下挑选排出第二极体或形成雌雄原核的受精卵，在G‑1PLUS培养液中洗涤后，转移至G‑1PLUS培养液中继续，待受精裸卵发育至8‑细胞胚胎阶段时，转移胚胎至G‑2PLUS2培养液中继续培养；所述HTF受精液的组分为：101.6mM氯化钠+4.69mM氯化钾+0.37mM磷酸二氢钾+0.2mM硫酸镁+2.04mM氯化钙+25mM碳酸氢钠+21.4mM乳酸钠+0.33mM丙酮酸钠+2.78mM葡萄糖+4mg/ml BSA。