[发明专利]铁调素治疗高铁抑制骨形成的斑马鱼模型构建方法

摘要

本发明公开了一种铁调素治疗高铁抑制骨形成的斑马鱼模型：以斑马鱼受精卵为模型，用不同浓度的枸橼酸铁铵FAC干预，第4天进行茜素红染色并统计骨矿化面积，选择FAC最适干预浓度；显微镜下挑选发育至1-2细胞期的斑马鱼受精卵，注射不同浓度的带Flag标签的铁调素mRNA，注射卵置于含100μg/mL FAC的培养液中，干预至第4天进行茜素红染色，得到铁调素治疗高铁抑制骨形成的斑马鱼模型。近年来许多研究表明铁代谢与骨代谢之间存在相关性，而斑马鱼作为模型，优势在于其在受精后20天才有破骨细胞出现，故本模型能有效研究铁代谢对骨形成的影响。同时，目前市售铁调素价格较高、生产厂家较少且生物活性不确定，而本模型的铁调素来源于斑马鱼序列，生物活性较肯定。

主权项

铁调素治疗高铁抑制骨形成的斑马鱼模型的构建方法，包括以下步骤：（1）将受精小于2小时的斑马鱼胚胎，置于枸橼酸铁铵FAC溶液中，采用静水式换水补药法培养至第4天，茜素红染色统计骨形成面积，以此确定枸橼酸铁铵FAC的干预浓度；（2）提取斑马鱼RNA反转录成cDNA，根据斑马鱼铁调素hepcidin基因全长，设计扩增全编码区引物，将此扩增的hepcidin全长序列与pcDNA3.1(+)Flag载体进行连接，构建成pcDNA3.1(+)Flag‑hepcidin表达质粒；（3）取构建好的表达质粒pcDNA3.1(+)Flag‑hepcidin，在体外转录成带帽的hepcidin‑Flag mRNA，显微镜下对受精卵进行mRNA注射；（4）将步骤（3）注射卵置于枸橼酸铁铵FAC溶液中，采用静水式换水补药法培养至第4天，茜素红染色统计骨形成面积，得到铁调素治疗高铁抑制骨形成的斑马鱼模型。