[发明专利]一种抑制金黄色葡萄球菌QS系统表达的方法

摘要

本发明公开了一种抑制金黄色葡萄球菌QS系统表达的方法，包括PCR引物设计、提取RNA、RNA逆转录、PCR扩增目的基因和实时荧光定量PCR分析。在含有金黄色葡萄球菌的培养基加入不同浓度的黄芩素，培养10~12h后，提取其反应后的RNA，再将RNA进行逆转录，然后用PCR扩增目的基因。

主权项

一种抑制金黄色葡萄球菌QS系统表达的方法，包括PCR引物设计、提取RNA、RNA逆转录、PCR 扩增目的基因和实时荧光定量PCR分析，其特征在于，具体步骤如下：（1）PCR引物设计；（2）提取RNAA．细菌培养和收集：将复壮后的金黄色葡萄球菌置于3mlTSB‑G液体培养基中，温度35~37℃、转速180rpm/min恒温摇床培养10~12h后，将菌悬液1：100转接至另一TSB‑G培养基中，加入黄芩素，加入黄芩素的浓度为16~64μg/ml，再加入DMSO，使培养基中的DMSO浓度一致，温度35~37℃、转速180rpm/min恒温摇床培养10~12h，培养5h后取 1ml 上述溶液于无菌且含RNA酶的1.5ml离心管中，温度4~5ºC、转速6000rpm/min离心收集细菌，弃去上清液，用tip头吸出剩余的培养液； B．用pH 为8.0的TE buffer溶解溶菌酶和溶葡萄球菌酶，配成浓度为10mg/ml和1mg/ml溶液，分别取100μl和10μl的重悬细胞，35~37 ℃处理30min，离心1min，弃上清液；C．加入1ml RNAiso^TM plus，tip头吹打并用震荡器使溶液混匀进行均质化；D．将均质化的样品放置在冰上5 min后，加入200μl 氯仿，用震荡器震荡15s，再置于冰上2~3 min，温度4℃、转速12000rpm/min离心15min，分为酚氯仿相和水相；E．将水相转移至一个新的离心管，加入0.8倍体积的异丙醇，振摇均匀，‑20~‑25℃放置20min，后在温度4℃、转速12000rpm/min离心15min，弃上清液；F．加入70％酒精，洗去离心管沉淀的盐分，用Tip头将沉淀打散，在温度4℃、转速12000rpm/min离心10min，弃上清液；室温晾干后，加入无RNase 的水溶解使DNase消化；G．DNase消化后用RNase‑free水溶解，用紫外分光光度计分析RNA 浓度，在260nm和280nm测定吸光度，用1％琼脂糖进行RNA电泳；（3）RNA逆转录1）取2μg步骤（2）提取的RNA作为模板，加入1μl引物，再加入DEPC水使总反应体系体积为12μl，混匀，离心，65~68℃孵育5min，合成第一链；2）在步骤1）的反应体系中依次加入4μl 5×reaction buffer，1μl 20u/μl Ribolock^TMRNA酶抑制剂，2μl 10mM dNTP MIX，1μl 200u/μl逆转录酶，混匀，离心，用PCR仪进行逆转录反应，反应条件为42℃、60 min→70℃、5min→4℃、∞；3）将步骤2）逆转录获得的RNA放置在4℃条件5min，用于qRT‑PCR，为cDNA；（4）PCR 扩增目的基因以逆转录后的cDNA为模板，进行PCR扩增， PCR反应体系如下： 试剂 用量 ddH₂O 9.5μl 2×Taq PCR Master Mix 12.5μl Forward Primer 1μl Reverse Primer 1μl cDNA模板 1μl 总体积 25μl PCR反应条件：热启动95℃、5min，变性94℃、1min，退火58℃、1min，延伸72℃、1min，扩增35个循环；后在72℃温育5min，取5μl PCR扩增产物，以1×TBE为缓冲液，120V电压电泳25min，I型核酸染料染色，进行2%琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像系统观察拍照；（5）实时荧光定量PCR分析用FastStart Universal SYBR Green Master荧光定量PCR试剂盒配制目的基因及内参基因荧光定量PCR反应体系，Setpone Plus ABI实时荧光定量PCR仪进行扩增反应，以5μg RNA逆转录合成cDNA，依次将浓度稀释10倍至10⁵倍，以各浓度的cDNA为模板，分别配制好总反应体系，4℃离心后置于实时荧光定量PCR仪进行扩增；按下列组份配制荧光定量PCR反应体系 试剂 使用量2×SYBR Premix Ex Taq TM 12.5μl10 μM PCR Forward Primer 0.5μl10 μM PCR Reverse Primer 0.5μlcDNA 2μl灭菌ddH₂O 9.5μlTotal 25μl荧光定量 PCR 反应条件为：95℃、 10min激活DNA聚合酶；95℃、15s→60℃、60s，进行40个循环，在每一步的延伸阶段读取荧光染料信号；最后测定产物溶解曲线，95℃、15 s→60 ℃、60 s→95℃、15 s。