[发明专利]无血清悬浮细胞生产重组腺病毒的方法及其药品制剂生产方法

摘要

一种无血清悬浮细胞生产重组腺病毒的方法，包括如下步骤：（1）细胞扩增；（2）生物反应器接种，培养液灌注培养和细胞再扩增；将从转瓶收获的细胞接种到生物反应器内进行培养；培养液的pH和溶氧(DO)值由生物反应器的控制器通过pH和溶氧探头来自动控制；其中，pH控制在6.5-8.2之间，DO控制在15%-75%之间；培养液的温度由生物反应器平台内的电加热器来自动控制在36–37℃之间；摇摆速度控制在15–20rpm之间，摇摆角度控制在8-15度之间；（3）细胞的稀释和转送到大体积的生物反应器；（4）重组腺病毒感染和扩增。本发明公开了一种基于无血清悬浮细胞生产重组腺病毒的方法，该方法可以实现大规模工业化，安全和经济有效的GMP生产重组腺病毒产品。

主权项

一种无血清悬浮细胞生产重组腺病毒的方法，包括如下步骤：（1）细胞扩增取1x10⁷到1x10⁸个无血清悬浮细胞工作细胞库的细胞，融化后接种到细胞培养用转瓶内，接种密度为3x10⁴到9x10⁴/毫升；在37℃,5%二氧化碳孵箱内培养；所述细胞培养用转瓶的摇转速度在50–150rpm；培养细胞密度到2x10⁶/毫升时，用新鲜培养液稀释细胞浓度到2x10⁵/毫升，并扩增到更大的转瓶内，继续培养；重复上述细胞扩增的操作，直到用于接种的细胞量达到2x10⁹以上；（2）生物反应器接种，培养液灌注培养和细胞再扩增将从转瓶收获的细胞接种到生物反应器内进行培养；培养液的pH和溶氧DO值由生物反应器的控制器通过pH和溶氧探头来自动控制；其中，pH控制在6.5‑8.2之间，DO值控制在15%‑75%之间；培养液的温度由生物反应器平台内的电加热器来自动控制在36–37℃之间；摇摆速度控制在15–20rpm之间，摇摆角度控制在8‑15度之间；当细胞在生物反应器内生长到浓度至2.0‑3.0x10⁶/毫升时，开始培养液灌注培养，来不断的提供养分和排除细胞代谢有害副产品；在灌注培养时，用过的培养液，通过过滤膜底部的细小空隙和过滤膜连接的乳胶管，被抽出生物反应器到废液桶内；细胞被保留在反应器内；生物反应器的重量控制系统会同时将同等重量的新鲜培养液，经过另外一个乳胶管输入到反应器内，以保持细胞培养体积的恒定；调节培养液灌注量来保持生物反应器内培养液的葡萄糖浓度不低于1.5g/升；（3）细胞的稀释和转送到大体积的生物反应器继续培养细胞；当细胞浓度达到1.0x10⁷/毫升时，将细胞从当前的生物反应器转送到十倍体积的用于重组腺病毒的感染的下一个生物反应器；该生物反应器预先已加有了90升新鲜培养液；培养液的pH和溶氧DO值有生物反应器的控制器通过pH和溶氧探头来自动控制；pH控制在6.5‑8.2之间；DO控制在15%‑75%之间；培养液的温度通过生物反应器的电加系统来自动控制在36–37℃之间；生物反应器的摇摆速度控制在10–15rpm之间，摇摆角度控制在8‑15度之间，如果采用搅拌式生物反应器，则搅拌速度控制在50‑100rpm之间；（4）重组腺病毒感染和扩增取重组腺病毒的工作病毒库病毒来感染生物反应器内的细胞；病毒感染复数控制在10–100vp/细胞之间，病毒感染后，细胞培养参数维持不变，病毒感染过程中不需要再添加新鲜培养液；培养4天，重组腺病毒会释放到培养液内；从反应器内收获含有重组腺病毒的培养液。