[发明专利]不同菌种对人参发状根的影响及应用方法

摘要

本发明涉及不同菌种对人参发状根的影响及应用方法，属于作物生物技术领域。其过程包括如下方面：(1)外植体处理；(2)菌种的保存与活化；(3)人参发状根诱导条件的优化；(4)人参发状根的获得与鉴定；(6)人参发状根再生体系的建立及条件优化；(7)发状根再生植株途径中生理生化特性的研究。(8)人参发状根及其培养物的组织学观察与核型分析。本发明以发根农杆菌侵染人参诱导发状根，提出了发状根诱导的若干影响因素及发状根再生植株过程，为人参的种质资源保存、创新保存提供了一条新途径，为人参的育种奠定基础。

主权项

1.一种不同菌种对人参发状根的影响及应用方法，其特征在于：其过程包括如下方面：(1)外植体处理：(I)人参种子萌发及处理：经过沙藏层积处理，已经开裂的种子，播种到栽培盘中，遮荫培养，待播种1～2周苗长出后，用0.1％L汞消毒6min，无菌水清洗5次；将其叶片、带叶幼茎和茎段切成1.0cm的切段，接于MS固体培养基上预培养用作转化的外植体材料；(II)人参一年、两年、三年生根的处理：将人参三年生根表面用清水清洗干净后，流水冲洗3～4h，用0.1％升汞消毒10～20min后，无菌水清洗5遍，切成0.2cm厚的薄片放在MS固体培养基上待用；(2)菌种的保存与活化：发根农杆菌的长期保存方法是将农杆菌溶于20％甘油中，于-80℃条件下保存；短期保存的方法是将发根农杆菌接种于YEB固体培养基上培养，当长出菌斑后，于4℃冰箱中保存；无菌条件下，用接种针挑取保存菌液，于YEB固体平板上划线，28℃置于黑暗条件下培养，直到长出单菌落；挑取一个单菌落接种于50mL液体YEB培养基中，120r／min、28℃、暗条件下培养24h，此时YEB液体培养基由接种前的透明的红棕色变成浑浊的淡黄色，证明细菌已正常长出；取1mL已活化的菌液加入50mL的YEB液体培养基中，120r／min，28℃暗条件下培养，活化菌液达到生长对数期，此时菌液就可以作为侵染用；(3)人参发状根诱导条件的优化，包括：(3a)不同菌种对人参发状根诱导率的影响：选择发根农杆菌R1601、8196、A4、rolA、rolB、rolC六个菌种经平板活化后接入YEB液体培养基，待其菌液生长浓度达到OD₆₀₀=0.6时用于侵染；2～3周苗龄的人参实生苗叶片，选择生长良好幼嫩的，在无菌条件下切成0.5cm×0.5cm的小块投入菌液中，25±1℃摇床100～120r／min侵染15～30min，无菌条件下取出；灭菌滤纸吸干表面菌液，接于MS培养基上，考察不同菌种对人参发状根诱导率的影响；(3b)不同外植体对人参发状根诱导率的影响：选择外植体为2～3周苗龄人参实生苗的叶片、茎段、叶柄和人参芽胞、人参愈伤组织、一年、二年、三年生人参根，选择菌种为发根农杆菌A4，考察人参外植体的选择对发状根诱导率的影响；其中叶片、茎段、叶柄、人参芽胞为叶盘法，浸染时间为15～30min，人参愈伤组织、人参一年、二年、三年生根为滴加法；(3c)预培养时间对人参发状根诱导率的影响：选择MS固体培养基为预培养基质，选择2～3周人参实生苗的茎段为材料，预培养时间选为12h、24h、48h、72h、96h，以考察预培养时间对人参发状根诱导率的影响；(3d)NAA浓度对人参发状根诱导率的影响：以2～3周人参实生苗的茎段为材料，MS基本培养基中添加NAA的浓度选择为0mg／L、2mg／L、4mg／L、6mg／L，比较发状根诱导率考察NAA最适浓度；(3e)基质与共培养时间对人参发状根诱导率的影响：选择共培养时间为12h、24h、36、48h，共培养培养基选为MS、1／2MS；外植体为实生苗的叶片，预培养培养基为MS+NAA2.0mg／L时间为48h，菌种为A4，以考察基质与共培养时间对人参发状根诱导率的影响；(3f)菌液浓度对人参发状根诱导率的影响：制备好的菌液用YEB液稀释至OD₆₀₀值为0.2、0.4、0.6、0.8和1.0，将人参实生苗叶柄投入不同浓度的菌液中浸染15～30min，25±1℃摇床100～120r／min，然后取出用无菌滤纸吸干表面的菌液，在共培养基上培养2d后，再转接到MS共培养培养基上，每隔7d换一次培养基；(3g)AS与侵染时间对人参发状根诱导率的影响：挑取的单菌落接种于添加AS的30mL YEB液体培养基中活化，AS浓度选为0、100、200μmol／L振荡培养，待其光密度值为0.6时将人参实生苗的茎段浸入，侵染时间选为10min、15min、20min、25min和30min；(3h)Cef浓度对抑菌和侵染的影响：Cef的浓度选择为200、300、400、500、600mg／L，除菌基质选择为MS基本固体基质；综合比较综合抑菌效果、污染率、获得发根数三项指标，考察Cef的最优浓度；(4)人参发状根的获得与鉴定：(4a)人参发根的获得：①外植体预培养：人参实生苗消毒后，将其叶片切成1.0cm×1.0cm的小块，叶柄、和茎切成1.0cm长的段，人参一年、二年、三年生根流水冲洗去表面浮土，经升汞消毒后蒸馏水3～5遍冲净，视材料厚度切成0.2～0.5cm薄片，将以上材料接于MS+NAA2mg／L培养基中黑暗条件下培养48h用于侵染；②侵染与共培养：在超净工作台上，将预培养的外植体，转移到装有备好菌液的三角瓶中，封口后放在120r／min，暗条件下的摇床上感染10～30min，感染后的外植体用无菌滤纸吸干表面菌液，接种到MS固体培养基中，于黑暗、25℃条件下共培养48h；③除菌培养：将共培养后的感染材料用无菌水冲洗三遍，无菌滤纸吸干外植体表面的无菌水，将其转接到含有Cef500mg／L的MS固体培养基上培养，于黑暗、25℃条件下除菌培养；(4b)人参愈伤与一年、二年、三年生根发状根的诱导：用微量移液器吸取活化的菌株8μL滴到已接到MS固体培养基的人参愈伤组织切面与人参根切片上，避免菌液滴到MS固体培养基上，25℃、黑暗条件下培养，2周后除去褐化死亡的，转移到新鲜的MS固体培养基上继续培养；(4c)PCR分子检测：采用PCR方法对质粒T_L-DNA的rolB基因检测，步骤为：①引物设计及合成：质粒T_L-DNA序列分析结果，设计了rolB基因的特异引物prolc1和prolc2：引物1：5′-GCTCTTGCAGTGCTAGATTT-3′；引物2：5′-GAAGGTGCAAGCTACCTCTC-3′；利用以上引物可通过PCR扩增到T-DNA上rolB基因的片段，预期长度是423bp；②CTAB法提取人参发状根总DNA；③提取发根农杆菌的Ri质粒；④PCR循环参数：⑤PCR反应体系：超纯水定容至20μL；⑥琼脂凝胶电泳，成像系统下照相；(5)人参发状根液体与固体培养生长量与总皂苷含量的测定：发状根液体培养采用1／2MS液体培养基为基本培养基(3％蔗糖，pH值5.8～6.0)，将10条生长旺盛的约2cm的发状根根尖接入装有30mL1／2MS液体培养基中，温度为24±1℃，摇床转速100r／min，每隔5d取样，测定发状根干重及人参总皂苷的含量，测定一个半月；所有数据为3瓶的平均值，重复3次；绘制标准曲线测定发状根中总皂苷含量：①取Rg10.020g溶于甲醇中，定容为2mg／mL；②取Rg1对照品溶液30、60、90、120、150μL；③分别置于5支试管中(10mL，具塞)，甲醇定容为150μL，以相应试剂作对照；④将试管置于冰水浴中加5％香草醛醇溶液和72％硫酸摇匀，60℃恒温水浴20min；⑤冰水浴15min后在755分光光度仪544nm处检测。以人参为标准品比色测定，根据标准曲线Y=503.29X+4.456，R²=0.9924求得样品皂苷含量(％)；发状根中总皂苷的测定方法为，取一定量液体培养的新鲜发状根，蒸馏水冲洗后，用滤纸吸干发状根表面的水分，称量发状根鲜重。然后于真空干燥箱中80℃下干燥至恒重，称量；将干燥后的发状根粉碎，放入三角瓶中，加入一定量的浓度为40％的乙醇溶剂，并将三角瓶口用封口膜密封；置于超声发生器中进行分离提取，提取时间15min，超声频率为28KHz，提取两次；在冰水浴中加5％香草醛醇溶液和72％H₂SO₄染色，60℃恒温水浴10min，冰水浴15min，于544nm处测吸光度；(6)人参发状根再生体系的建立及条件优化：(6a)人参发状根愈伤组织的诱导：以人参发状根为外植体，置于添加不同浓度，不同组合的2，4-D、BA、KT等生长调节物质的MS培养基上，蔗糖浓度为30g／L，琼脂6.5g／L，pH值调至6.0(灭菌前)，灭菌压力为0.1MP持续15～20min；放置于不同光照强度下，诱导温度为24±1℃，光照周期为12h，弱光培养，12d后统计愈伤组织诱导率(产生愈伤组织的外植体数／外植体总数)分析各类生长调节物质与光照强度对愈伤组织诱导作用的大小，筛选最佳种类及浓度组合和光照强度；(6b)人参发状根的器官发生：①不同激素浓度、组合与光照对丛生芽生长和分化的影响：分别取不同浓度及组合的KT、IBA GA35.0mg／L生长调节物质的不同浓度组合对培养物进行处理，分析各物质对培养物生长、分化的影响，筛选出长势及生物量均达到理想水平的最优培养基配方；取黑暗、弱光、强光三个光照条件，观察光对培养物的影响；其中弱光为培养室内正常采光度(约1000Lx)，光周期同正常日变化。强光由日光灯提供(约2000Lx)，光周期为10h／d；②不同激素配比对生根的影响：分别取不同浓度及组合的NAA、IBA、GA₃5.0mg／L生长调节物质的不同浓度组合对培养物进行处理，分析各物质对根长势和生根情况的影响，筛选出长势及生物量均达到理想水平的最优培养基配方；(7)发状根再生植株途径中生理生化特性的研究：(7a)考马斯亮蓝G-250染色法测定蛋白质含量：牛血清白蛋白配成含蛋白质100μg／mL的标准蛋白溶液。以蛋白质浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线：Y=0.0052X-0.0253R²=0.9905；称取鲜样各1g放入研钵中，加2mL蒸馏水研磨成匀浆，转移到离心管中，再用6mL蒸馏水洗涤研钵，洗涤液收集于同一离心管中，在室温(20～25℃)下放置1h以充分提取，然后4000r／min离心20min，弃去沉淀，上清液转入10mL容量瓶，并以蒸馏水定容；另取两只10mL具塞试管，分别吸取样品蛋白质提取液0.1mL，放入具塞刻度试管中，加入5mL考马斯亮蓝G-250溶液，充分混匀，放置2min后以空白为对照，在595nm下比色，记录吸光值，并通过标准曲线查得蛋白质含量，采用下式计算：式中X-根据样品的吸光度查得的标准曲线值(μg)；V_T-提取液总体积(mL)；W-样品鲜质量(g)；V_s-测定时加样量(mL)；N-稀释倍数；(7b)蒽酮法测定可溶性糖含量：将分析纯葡萄糖在80℃下烘至恒重，精确称取0.100g，配置成100μg／mL的标准葡萄糖溶液。以葡萄糖浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线：Y=0.0064X+0.0035R²=0.9991；称取材料0.20g，，剪碎放入支刻度试管中，加入8mL蒸馏水，塑料薄膜封口，于沸水中提取30min(提取2次)，提取液过滤入25mL容量瓶中，反复冲洗试管及残渣，定容至刻度，吸取0.5mL样品液于试管中，加蒸馏水1.5mL，加入5mL蒽酮硫酸试剂，在630nm波长下测光密度，采用下式计算：式中C-从标准曲线查得的糖量(μg)；V_T-提取液总体积(mL)；V_S-测定时取用的样品体积(mL)；W-组织重量(g)；N-稀释倍数；(7c)淀粉含量的测定：准确称取100mg纯淀粉，配置成每毫L含淀粉100μg的标准液，以淀粉浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线：Y=0.0021X+0.0359R²=0.9658；将提取可溶性糖以后的残渣，移入50mL容量瓶中，加20mL热蒸馏水，放入沸水浴中煮15min，再加入9.2mol／L HCLO₄2mL提取15min，冷却后，混匀，2500r／min离心10min，并用蒸馏水定容，加入5mL蒽酮硫酸试剂，在630nm波长下测光密度，采用下式计算：式中C-由标准曲线得到的淀粉质量(μg)；V-提取液量(mL)；W-组织重量(g)；a-显色时吸取液体积(mL)；(7d)过氧化物酶活性测定：反应混合液的制备：100mol／L pH6.0磷酸缓冲液50mL于烧杯中，加入愈创木酚28μl，于磁力搅拌器上加热搅拌，直至愈创木酚溶解，待溶液冷却后，加入30％H₂O₂19μL，混合均匀，保存于冰箱中备用；取材料2g放入研钵中，加5mL pH6.0磷酸缓冲液研磨成匀浆，以4000r／min离心15min，上清液转入20mL容量瓶中，残渣再用5mL磷酸缓冲液提取一次，上清液并入容量瓶中，定容至刻度，贮于低温下备用；取混合液3mL和磷酸缓冲液1mL为对照，混合液3mL加入酶液1mL立即开始计时，于470nm波长下测吸光度值，每隔1min度数1次：式中ΔA₄₇₀-反应时间内吸光度变化；W-材料重量(g)；T-反应时间(min)；V_T-提取酶液总体积(mL)；V_S-测定时取用酶液体积(mL)；(7e)过氧化氢酶活性测定：取不同时期材料各1g加3mL预冷过的pH7.8的磷酸缓冲液，放入研钵中研磨成匀浆，转移至25mL容量瓶中，冲洗研钵数次合并缓冲液定容至刻度，置于5℃冰箱静置10min取上液，4000r／min离心15min，取上清液再次离心，得上清液5℃保存备用；取10mL试管3支，其中两支为测定一支为空白；S0管于沸水中煮1min，冷却。所有试管25℃预热，逐管加入0.3mL0.1mol／L的H₂O₂，立即计时，240nm测吸光值，每间隔1min读数一次，采用下式计算：ΔA240=AS0-AS1+AS22]]>式中A_S0-反应时间内对照管吸光度；A_S1、A_S2-样品测定管吸光度；W-样品鲜质量(g)；t-反应时间(min)；V_T-提取酶液总体积(mL)；V_S-测定时取用酶液体积(mL)；0.1表示A₂₄₀下降0.1时的一个酶活性单位(U)；(7f)多酚氧化酶活性测定：取2g体细胞胚发生中各时期材料置于预冷研钵中，加入0.2g PVP、5mL0.05mol／L pH8.0磷酸缓冲液充分研磨成均浆。3000r／min4℃条件下离心15min，取上清加入25mL容量瓶中，用缓冲液再次提取残渣，合并上清，定容，低温保存备用；30℃水浴恒温10min，在398nm波长下测定吸光值，采用下式计算：式中，A₃₉₈-反应时间内吸光度变化；W-材料重量(g)；t-反应时间(min)；V_T-提取酶液总体积(mL)；V_S-测定时取用酶液体积(mL)；(8)人参发状根及其培养物的组织学观察与核型分析：(8a)石蜡切片及显微结构观察：①固定：选取发状根、发根诱导的愈伤组织和胚性愈伤组织，分割成小于1cm左右的小块，材料用FAA固定液固定24h，r／min入70％酒精保存于4℃冰箱里；②脱水、透明、透蜡与包埋：室温下经70％，85％，95％，100％，100％的乙醇中，脱水各2h，乙醇：二甲苯=1：1过夜，纯二甲苯二次各1.5h，二甲苯：石蜡=1：1，50℃12h，纯石蜡二次60℃各12h的透明、透蜡过程，最后包埋在熔融石蜡中，待冷却凝固即可；③切片、贴片：蜡块经修整后，用旋转切片机切成10μm的连续蜡带，再进行贴片，35℃展片烘干12h；④染色、封片：铁矾-苏木精染色法染色，加拿大树胶封片，TS100型倒置显微镜下观察并照相；(8b)核型分析：①取材及预处理：上午9～10时取发状根根尖0.5cm，愈伤0.5cm×0.5cm小块，丛生芽0.5cm叶尖用对二氯苯溶液在室温处理6～12h。②固定：将预处理过的述材料用蒸馏水冲洗3～5次，然后移入卡诺氏固定液中4～15℃条件下固定24h，蒸馏水冲洗，放入0.075mol／L液中低渗，在25～30℃条件下，发状根处理6min，愈伤组织和芽30min，70％乙醇冲洗2次后转入70％乙醇中保存备用。③酸解：将材料从70％乙醇中取出，用蒸馏水漂洗.然后放入已经在60℃水浴锅中预热的1mol／LHCI中，在60℃恒温条件下解离10～15min，取出用蒸馏水冲洗2～3次(约10min)；④制片：将解离冲洗后的材料置于30～40℃、4％的铁矾水溶液中染色1h，蒸馏水洗涤4～5次.每次约5min，置于5％苏木精水溶液中染色2h，蒸馏水冲洗5～10min，45％的醋酸20min，压片。压片时，用镊子取根尖置于载玻片上，切下根尖分生组织；将其切成薄片，滴一滴45％的醋酸，迅速捣碎材料，加盖玻片压片。选染色体分散良好的片子冰冻揭盖片，放入烘箱，40℃干燥1h；室温下自然干燥24h以上，二甲苯透明，中性树胶封片。