[发明专利]一种红鳍东方魨卵巢细胞系体外构建方法及其应用

摘要

本发明涉及一种红鳍东方魨卵巢细胞系体外构建方法及应用，构建方法步骤有：（1）原代细胞培养液的制备；（2）原代培养；（3）传代培养；（4）不同形态细胞系的分离，其应用包括有：红鳍东方魨卵巢细胞系在两种典型鱼类病毒增殖和扩繁中的应用及红鳍东方魨卵巢细胞系在转基因研究中的应用。本发明选择卵巢作为培养和建系对象旨在为研究河豚毒素的提取利用和养殖河豚鱼的安全脱毒处理搭建一个生物平台，更好的服务于传统的水产养殖业及新兴的生物医药行业。

主权项

一种红鳍东方魨卵巢细胞系体外构建方法，其特征在于步骤如下：（1）原代细胞培养液的制备：具体步骤包括：①基础培养基制备：1000ml MEM和L‑15培养基以2:1混合后的基础培养基，称取2.38g Hepes，溶解于超纯去离子水中，磁力搅拌混匀后，调节pH在7.5，然后抽滤灭菌后，为基础培养基；②红鳍东方鲀卵巢细胞完全培养基的制备：将占总体积20%的胎牛血清、1%的大菱鲆血清、占总体积0.1%的2‑巯基乙醇、2ng/ml人碱性成纤维细胞生长因子、1ng/ml白血病抑制因子、1nmol/L的丙酮酸钠及1nmol/L的谷氨酰胺加入到基础培养基中，由此制成红鳍东方鲀卵巢细胞完全培养基；（2）原代培养：具体步骤包括：①试验鱼选取：选取鱼龄为一年的体重约500g的健康雌性红鳍东方鲀；②试验鱼暂养：用含1000单位/毫升的青霉素和1000单位/毫升链霉素过滤消毒海水，用无菌海水暂养停止投喂的实验鱼，待实验鱼停止排遗达24h以上时，用捞网迅速将红鳍东方鲀取出置于75%酒精中浸泡2min；③卵巢获取及接种：将昏迷后的试验鱼在超净工作台中无菌解剖，取出卵巢，置于一次性的3.5cm培养皿中，PBS冲洗一次，70%酒精浸泡消毒3min后，PBS冲洗两次，用无菌眼科剪将性腺组织剪成大约1cm3及以下的小块；然后用0.75%的胰酶将剪碎组织块消化15分钟，PBS冲洗，过滤组织块，用无菌的200ul移液器吸头轻轻的吸取组织块，接种在25cm2的培养瓶中，接种时要均匀，尽量使多的组织块布满瓶底，平均每瓶中接种数量为5×6=30块；④原代培养：将培养瓶翻转，加入完全培养基2ml，倒置于24℃培养箱中培养，3h组织块贴壁后，轻轻翻转培养瓶，将培养瓶正置，轻晃培养瓶，使各组织块浸到培养液中，24h后补加完全培养液至4ml，隔天观察细胞贴壁及生长状态，每隔5天更换完全培养基的2/3，每次更换时吸出脱壁的组织块，约两周迁出的细胞长满瓶底后，进行传代培养；（3）传代培养：原代培养细胞以组织块为中心形成细胞集落，从而使整个瓶底细胞连成单层的一片，以0.25%的胰酶短暂消化细胞，迅速吸出，加入培养基吹打使细胞悬浮，以一瓶传两瓶的方式进行传代；根据细胞生长状态，5‑7天可传代一次；传至第30代时，细胞基本生长稳定，可以进行相关生理数据的测定；（4）不同形态细胞系的分离：组织块接种时，随着细胞贴壁扩繁，逐步呈现出两种形态 的细胞：一种为梭形上皮样细胞，另一种为鹅卵石形上皮样细胞，依据二者不同的贴壁附着特性，通过消化时间差异化处理，逐步将两种细胞分离，至第三代完全分离完成，形成两个红鳍东方鲀雌性卵巢细胞系，即TSOC1和TSOC2。