[发明专利]中国人群CYP21A2基因筛查用试剂盒

摘要

本发明公开了一种针对中国人群21-羟化酶基因(CYP21A2)的7个突变热点的一次性定性筛查试剂盒，所述试剂盒以中国人群CYP21A2上的7个常见突变位点为检测对象，分别设计出扩增引物和延伸引物，采用单碱基引物延伸基因分型(SNaPshot)技术，针对各个目的区段进行多重巢式PCR扩增和单碱基标记延伸，通过毛细管电泳分析，在一个反应管中一次性获得7个位点的基因型。本发明的筛查方法及试剂盒使用方便，操作简单，成本低，通量高，检测结果直接可靠，适合于中国人群CYP21A2基因突变的大规模筛查。

主权项

中国人群CYP21A2基因筛查用试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括以下内容：(1)反应试剂，包括dNTP、10×PCR缓冲液、25mM Mg2+离子、FastStart Taq酶、SNaPshot Multiplex混合液、SAP酶、Exon I酶及其配套的缓冲液的纯化试剂、纯合、杂合突变的阳性对照DNA样本、阴性对照样本的对照DNA样本；(2)等比例混合的针对CYP21A2基因5个区段进行巢式PCR扩增的正向引物和反向引物混合物I和II；(3)按一定比例混合的针对CYP21A2基因7个突变热点的PCR延伸引物混合物III；其中正向引物和反向引物混合物I是初级扩增引物，正向引物和反向引物混合物II是次级扩增引物；所述试剂盒以CYP21A2基因92位点的C→T突变，955位点的C→T突变，IVS2‑13位点的A／C→G突变，1069位点的C→T突变，844位点的G→T突变，518位点的T→A突变和Exon3的332‑339位点缺失8个碱基共7个位点为检测对象，针对每个位点的突变类型分别设计出扩增引物和延伸引物，针对各个目的区段同时进行巢式PCR扩增和标记延伸，通过毛细管电泳分析，一次获得7个位点的基因型；所述CYP21A2基因92位点的初级扩增引物序列、IVS2‑13位点的初级扩增引物序列、518位点的初级扩增引物序列和Exon3332‑339缺失8个碱基位点的初级扩增引物序列一致，即PF‑F1：5'‑TCGGTGGGAGGGTACCTGAA‑3’和PF‑R1：5'‑TCAGCTGCATCTCCACGATGTGA‑3’；所述CYP21A2基因844位点的初级扩增引物序列、955位点的初 级扩增引物序列和1069位点的初级扩增引物序列一致，即PF‑F2：5’‑CCTGTCCTTGGGAGACTACT‑3’和PF‑R2：5’‑TCTCGCACCCCAGTATGACT‑3’；所述CYP21A2基因92位点的次级扩增引物序列是PS‑F1：5’‑TACCTGAAGGTGGGGTCAA‑3’和PS‑R1：5’‑AAGGTGGCTCACACTTGAGG‑3’；所述CYP21A2基因IVS2‑13位点的次级扩增引物序列、518位点的次级扩增引物序列和Exon3332‑339缺失8个碱基位点的次级扩增引物序列一致，即PS‑F2：5’‑TATCTGGTGGGGAGAAAGCA‑3’和PS‑R2：5’‑CAGGAAGCATGAGAATGCAG‑3’；所述CYP21A2基因844位点的次级扩增引物序列、955位点的次级扩增引物序列和1069位点的次级扩增引物序列一致，即PS‑F3：5’‑GGCCATAGAGAAGAGGGATC‑3’和PS‑R3：5’‑AAGGCTAAGGGCACAACG‑3’。