[发明专利]唾液腺组织特异性表达外源蛋白的转基因载体和转基因猪及其构建方法

摘要

本发明公开了一种唾液腺组织特异性表达外源蛋白的转基因载体及其构建方法，所述表达载体是通过将葡聚糖酶基因、木聚糖酶基因、以及植酸酶基因构建重组的融合基因插入到腮腺组织特异性的转基因载体中构建得到的；将该载体导入猪的基因组，并采用体细胞核移植技术生产出转基因猪。本发明针对大麦原料葡聚糖酶，小麦、玉米中木聚糖酶，和植物性饲料中的植酸酶都有水解作用，利用猪唾液腺做为反应器，终生分泌，达到永久代替饲料中这些酶制剂的添加，更好的发挥这些酶的作用；本发明的表达载体具有piggyBac转座子，极大地提高了转基因效率，且将普通质粒串联重组的转基因整合模式变成了单位点单拷贝整合，更好的模拟生物基因的内环境。

主权项

一种唾液腺组织特异性表达外源蛋白的转基因载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)利用E2A、P2A和T2A的2A多肽序列将SEQ ID NO:1所示的葡聚糖酶基因Bg17、SEQ ID NO:2所示的葡聚糖酶基因Eg1314、SEQ ID NO:3所示的木聚糖酶基因XynB、以及SEQ ID NO:4所示的植酸酶基因APPA构建重组β‑葡聚糖酶基因‑木聚糖酶基因‑植酸酶基因融合基因BgEgXyAp；(2)、分别以质粒pcDNA3.1(+)和pT2AL200R175‑CAGGS‑EGFP为模板，SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6、及SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8为引物进行第一次PCR扩增，获得带有若干重叠序列的neo基因和EGFP基因；各取0.5‑3μL混合后作为模板进行第二次PCR扩增，纯化得到neo‑EGFP融合基因；用EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切pcDNA3.1(+)和neo‑EGFP融合基因，纯化回收酶切产物，连接，构建得到pcDNA‑Neo‑T2A‑EGFP载体；(3)、以质粒pPB‑UbC‑EGFP‑neo为模板，分别以SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10、及SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12作为引物，进行PCR扩增得到NotⅠ‑5‑PB‑NotⅠ，XhoⅠ‑3‑PB‑XhoⅠ，分别采用NotⅠ和XhoⅠ酶切后，连接在载体pPSPBGPneo‑XynB上，得到载体pPSPBGPneo‑PB‑XynB；(4)、以步骤(2)得到的pcDNA‑neo‑T2A‑EGFP载体为模板，用长片段PCR体系，SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14作为引物进行PCR扩增 得到infusion‑CMV‑neo‑T2A‑EGFP片段，切胶纯化；用ClaⅠ和BglⅡ双酶切步骤(2)得到的载体pPSPBGPneo‑PB‑XynB，对目的片段切胶纯化；将infusion‑CMV‑neo‑T2A‑EGFP片段重组到pPSPBGPNeo‑PB‑XynB载体的两个loxp位点中间，得到pPSPBGPneo‑T2A‑EGFP‑PB‑XynB载体；(5)、以步骤(4)得到的pPSPBGPneo‑T2A‑EGFP‑PB‑XynB载体为模板，SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16作为引物，进行PCR扩增，得到载体中的pPB‑lox‑neoEGFP‑loxp片段，并添加AgeI限制性内切酶位点，纯化，得到新载体骨架；(6)、以小鼠腮腺蛋白基因上游调控区的PCR扩增片段为模板，SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18为引物，扩增得到小鼠腮腺蛋白上游调控区的下游4009bp片段，将4009bp片段与新载体骨架pPB‑lox‑neoEGFP‑loxp中的重组序列进行重组，得到中间载体1；(7)、以小鼠腮腺蛋白基因上游调控区的PCR扩增片段为模板，以SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20为引物，扩增得到小鼠腮腺蛋白上游调控区的下游4706bp片段；将其重组到步骤(6)的中间载体1的StuI位点，即为中间载体2；(8)、以小鼠腮腺蛋白基因上游调控区的PCR扩增片段为模板，以SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22为引物，利用AgeI位点，扩增得到小鼠腮腺蛋白上游调控区的下游3956bp片段；将其重组到步骤(7)的中间载体2上，得到载体pPB‑MusPSP‑neo‑EGFP；(9)、将步骤(1)得到的β‑葡聚糖酶基因‑木聚糖酶基因‑植酸酶基因 融合基因BgEgXyAp用in‑fusion重组酶重组到步骤(8)得到的载体pPB‑MusPSP‑neo‑EGFP的ASCI位点，即得序列号为SEQ ID NO:35的四基因共表达的表达载体pPB‑MusPSP‑neo‑EGFP‑BgEgXyAp。