[发明专利]大鼠毛囊干细胞的分离培养方法

摘要

本发明涉及大鼠毛囊干细胞的分离培养方法，该方法包括以下步骤：1）选用一周龄SD大鼠触须部皮肤；用镊子和一次性注射器针头从皮下组织端拉出毛囊，收集形态完好且处于生长期的毛囊，显微镜下将毛囊切成三等份，取中间部分，PBS漂洗后放入50mL培养瓶中，加入DMEM/F12补充培养基，1周后毛囊隆突部有细胞爬出，形成克隆；2）培养条件为37℃、5%CO2培养箱中，每2-3d换液一次；3）毛囊干细胞的传代消化条件为：TrypLETMExpress(1X)，no Phenol Red，37℃消化8-10min；4)毛囊干细胞的纯化。本发明由于采用了上述的技术方案，得到了理想的毛囊干细胞。

主权项

大鼠毛囊干细胞的分离培养方法，其特征在于该方法包括以下的步骤：1）选用一周龄SD大鼠触须部皮肤，置入0.25%Dispase酶37℃消化2h；用镊子和一次性注射器针头从皮下组织端拉出毛囊，收集形态完好且处于生长期的毛囊，显微镜下将毛囊切成三等份，取中间部分，PBS漂洗后放入50mL培养瓶中，加入DMEM/F12补充培养基，1周后毛囊隆突部有细胞爬出，形成克隆；所述的DMEM/F12补充培养基成分为：44mlDMEM/F12培养液、5mlKSR血清替代物、500μl青链霉素混合液、500μl L‑谷氨酰胺、500μl非必需氨基酸、20ng/ml重组人表皮细胞生长因子、10ng/ml重组人碱性成纤维细胞生长因子、50μl羟基乙醇、10ng/ml氢化可的松；2）培养条件为37℃、5%CO2培养箱中，每2‑3d换液一次；3）毛囊干细胞的传代消化条件为：TrypLETMExpress(1X)，no Phenol Red，37℃消化8‑10min；4)毛囊干细胞的纯化：将100μg/ml的IV型胶原按照3ml/100mm dish的量包被在培养皿中，室温静置1h；将100mm培养皿的原代细胞用胰蛋白酶消化，离心收集细胞后，吹打成单细胞悬液接种于培养皿中，20min后，将未贴壁的细胞连同培养液一起吸出；贴壁的细胞用完全培养基培养，每3天换液；P2代再纯化一次。