[发明专利]肺癌靶向CHRNA5基因的shRNAs表达载体的构建、筛选及其用途

摘要

本发明涉及肺癌靶向CHRNA5基因的shRNAs表达载体的构建、筛选及其用途。本发明利用RNA干涉技术，针对CHRNA5基因的不同靶序列，以pLLU2G为载体，构建了两个能在哺乳动物细胞中表达shRNA的表达质粒CHRNA5-shRNA1/2。本发明肺癌靶向CHRNA5基因的shRNAs表达载体能高效的特异性的抑制CHRNA5基因表达，用于制备治疗高表达CHRNA5基因的肺癌的基因药物。

主权项

靶向CHRNA5基因的shRNAs表达载体，其特征是，以pLLU2G为载体，针对人尼古丁乙酰胆碱受体α5基因（CHRNA5）编码区上、下游的两段序列，在较高表达CHRNA5的肺癌细胞系A549中发挥RNA干扰作用；CHRNA5特异性RNA干涉靶序列分别为：①5'－GTCTTCTATCTTCCTTCAAAT－3’，起始于1101位；②5'－GCAGGTGTTTAATGCCATTTA－3’，起始于3472位，由以下方法制得：（1）RNA干涉靶序列的选择及插入序列的设计与合成选择CHRNA5基因编码区的两段序列①5'－GTCTTCTATCTTCCTTCAAAT－3’、②5'－GCAGGTGTTTAATGCCATTTA－3’，设计、合成两对互补的寡核苷酸序列，序列如下：①shCHRNA5寡核苷酸序列1：正义链:5'‑TGTCTTCTATCTTCCTTCAAATCTCGAGATTTGAAGGAAGATAGAAGACTTTTTC‑3'反义链：5'‑TCGAGAAAAAGTCTTCTATCTTCCTTCAAATCTCGAGATTTGAAGGAAGATAGAAGACA‑3’②shCHRNA5寡核苷酸序列2：正义链:5'‑TGCAGGTGTTTAATGCCATTTACTCGAGTAAATGGCATTAAACACCTGCTTTTTC‑3'反义链：5'‑TCGAGAAAAAGCAGGTGTTTAATGCCATTTACTCGAGTAAATGGCATTAAACACCTGCA‑3’，（2）合成的寡核苷酸分别与线性载体pLLU2G连接、转化、扩增及质粒的提取将步骤（1）合成的序列1的一对shCHRNA5寡核苷酸等量混匀，95℃作用2分钟后慢慢冷却至室温，得到结合的双链寡核苷酸shCHRNA5‑1；将步骤（1）合成的序列2的一对shCHRNA5寡核苷酸等量混匀，95℃作用2分钟后慢慢冷却至室温，得到结合的双链寡核苷酸shCHRNA5‑2；然后将上述双链寡核苷酸shCHRNA5‑1、shCHRNA5‑2分别与pLLU2G质粒载体连接得到pLLU2G‑shCHRNA5‑1或pLLU2G‑shCHRNA5‑2，最后分别转化到stb13细菌；（3）质粒的鉴定将步骤（2）提取的质粒DNA琼脂糖凝胶电泳，应用引物测序正向引物和测序反向引物进行PCR鉴定，紫外分光光度计分析测定质粒DNA的浓度和纯度，并进行插入片断测序，以确定合成的寡核苷酸是否已正确转入pLLU2G质粒中。