[发明专利]结核分枝杆菌的快速磁分离方法

摘要

本发明公开了富集分离结核分枝杆菌（Mycobacteriumtuberculosis，MT）的方法，更好地为目的菌进行后续研究提供基础，涉及生物技术领域。方法包括超支化聚合物与抗体共价偶联、抗体修饰的超支化聚合物再包被长链生物素分子、抗体和长链生物素共修饰的超支化聚合物捕获样品液中的目的菌、链霉亲和素修饰的纳米磁珠识别并偶联样品液中的长链生物素化超支化聚合物、被捕获细菌的分离及重悬等步骤；重悬液可以直接进行后续分析，与传统的细菌磁分离方法相比，该方法更适用于在复杂基质中对细菌进行磁分离，提高了样品中目的菌分离效率。

主权项

结核分枝杆菌的快速磁分离方法，其特征在于包括以下步骤：（1）称取0.5 mg超支化聚合物，悬浮于4 mL磷酸缓冲液（PBS，0.01 mol/L，pH 8.0）中，搅拌滴加25%的戊二醛水溶液545 μL，使戊二醛的终浓度为3%；在摇床150 r/min的转速下室温反应3.5 h；向上述溶液添加结核分枝杆菌MT特异性抗体12 mg，使其终浓度达到3 mg/mL左右；摇床150 r/min的转速下室温反应24 h；将上述溶液减压旋干溶剂，去离子水溶解，在PBS和去离子水中透析1 d；透析结束将得到的溶液冷冻干燥得超支化聚合物‑抗体复合物；（2）取15 mg长链生物素，悬浮于4 mL 0.01 mol/L pH 8.0 PBS磷酸缓冲液中，搅拌滴加25%的戊二醛水溶液545 μL，使戊二醛的终浓度为3%，在摇床150 r/min的转速下室温反应3.5 h；加入0.55 mg超支化聚合物‑抗体复合物，在摇床150 r/min的转速下室温反应24 h；减压旋干溶剂，去离子水溶解，在PBS和去离子水中透析1 d；透析结束将得到的溶液冷冻干燥得长链生物素‑超支化聚合物‑抗体复合物；（3）取1 mL待测样品溶液，加入0.1 mg MT抗体和长链生物素共修饰的超支化聚合物，置于混匀仪上，以30 rpm的转速室温孵育15 min；加入0.1 mg修饰有链霉亲和素的纳米磁珠，置于混匀仪上，以30 rpm的转速室温孵育15 min，常规磁力架分离3 min；（4）磁力分离后，去0.1%PBST清洗，用PBS缓冲液重悬即得捕获有结核分枝杆菌的纳米磁珠‑链霉亲和素‑长链生物素‑超支化聚合物‑抗体‑MT抗原复合物。