[发明专利]一种开发烟草中具多态性SSR分子标记的方法

摘要

本发明公开了一种开发烟草中具多态性SSR分子标记的方法。该方法抛弃了传统地通过对不同种质材料间基因组(或EST)测序、构建BAC文库再进行序列分析等手段发现烟草中存在的SSR多态性，采用MFLP(微卫星锚定片段长度多态性)技术对烟草种质材料进行基因分型，发现具有SSR标记特性的多态性片段；在此基础上，提取这些具有SSR多态性特性的DNA片段并分析其DNA序列，依据DNA序列设计出具有SSR特性的引物组合，使扩增产物的多态性与原MFLP标记多态性一致。这样我们一方面完成了利用MFLP标记对烟草进行多态性分析，同时将具SSR特性的MFLP标记进行转换，开发出具多态性的SSR标记。

主权项

一种开发烟草中具多态性SSR分子标记的方法，该方法由以下步骤组成：(1)种植遗传背景差异较大的烟草种质材料4‑12份，采收幼嫩叶片，提取各个材料的基因组DNA，并将DNA的浓度调整到100‑200μg/μL；(2)用MseI核酸内切酶切割各个材料的基因组DNA，之后利用T4DNA连接酶将酶切片段与两个MseI接头连接；(3)选用一个SSR锚定引物、另一个为MseI引物，以步骤(2)中的产物作为DNA模板，进行PCR扩增，扩增程序为94℃预变性2min，再经过25个PCR循环(94℃30s，52℃30s，72℃1min)，获得预扩增产物；(4)利用一个SSR锚定引物和MseI选择性扩增引物(MseI引物+N，N为1‑3个随机的核苷酸)，以预扩增产物作为底物进行选择性扩增，扩增的PCR程序为94℃30s、60℃(每个循环下降0.7℃)30s和72℃1min，循环9次，再按94℃30s、54℃30s、72℃1min循环25次。选择性扩增产物经LICOR DNA遗传分析仪和(或)银染检测烟草种质材料中存在的多态性；(5)用锋利刀片切割具SSR标记特性的多态性条带，提取出条带中的DNA，并以此DNA作模板，利用步骤(4)中的PCR引物组合进行PCR扩增；(6)利用T4DNA连接酶将扩增产物与pGEM‑T Easy连接，之后将连接产物转化到大肠杆菌DH5α中，37℃条件下LB固体培养基培养，挑选白斑克隆4‑12个，提取质粒DNA；(7)测定质粒DNA中插入片段的DNA序列，根据序列设计出多对SSR引物组合；(8)以4‑12个烟草种质材料的基因组DNA作模板，用设计出的SSR引物组合进行PCR扩增，运用琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物的多态性，并比较其多态性与MFLP标记的一致性，最后确定出原MFLP多态性一致的SSR引物组合，实现将MFLP多态性标记成功转换成具多态性的SSR标记。