[发明专利]一种菊花SSR引物的开发方法

摘要

本发明属于生物技术领域，公开了一种菊花SSR引物的开发方法。利用NCBI数据库现有的序列数据，结合Perl编程语言方法，对大量序列信息进行批量处理，进行SSR序列查找和SSR标记引物设计，克服了SSR开发效率低、耗时久、成本高等障碍。以不同栽培菊花品种为材料，对设计的SSR引物进行验证，若有条带检测出，即为成功的SSR引物。应用本方法成功地设计了363对SSR引物，为菊花SSR引物开发进而实现分子标记辅助选择育种和比较基因组学研究等提供了新的方法和思路。

主权项

一种菊花SSR引物的开发方法，其特征在于包含如下步骤：1）菊花EST序列的获得登陆NCBI网站，选择dbEST数据库，进行菊花EST数据检索，将获取到的序列利用序列克隆载体去除软件VecScreen进行处理，去除序列中污染的克隆载体序列；2）菊花SSR序列的识别安装Perl语言5.16版本，从http://pgrc.ipk‑gatersleben.de/misa/下载est_timmer.pl并运行est_timmer.pl去除EST序列中过短的序列和过长的序列；从http://www.bioinformatics.org/cd‑hit/中下载CD_HIT软件，利用其去除冗余序列；从http://pgrc.ipk‑gatersleben.de/misa/下载misa.pl程序以识别和定位序列中的SSR，参数设置如下：单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸的重复次数至少为15、6、5、4、3。3）菊花SSR引物的设计使用primer3模块http://sourceforge.net/projects/primer3/files/primer3/1.1.4/p rimer3‑1.1.4‑WINXP.zip/download批量设计SSR引物，引物设计参数为引物长度18‑22bp，Tm55‑65℃，其中前后引物Tm值相差4℃，产物大小为100‑400bp；4）菊花SSR引物有效性和通用性鉴定提取不同栽培菊花的DNA，统一稀释为50ng/μl，‑20℃保存备用。PCR反应体系采用10μL的反应体系，其中包括50ng模板DNA，1.5mmol·L‑1Mg2+、400μmol·L‑1dNTPs、0.5U TaqDNA聚合酶、1μmol·L‑1引物及10×PCR buffer。SSR反应程序为：94℃预变性5min；然后进入30个循环94℃变性30s，55‑60℃复性30s，72℃延伸30s，最后72℃延伸10min。反应结束后，产物加入2μL loading buffer，以100bp DNA ladder为DNA分子量标准，采用8%的非变性聚丙烯酰胺进行电泳，电泳缓冲液为0.5×TBE，200V稳压电泳2‑2.5h，至loading buffer移到凝胶底部时电泳结束。电泳结束后，采用银染法染色，最后将凝胶置于凝胶成像系统上拍照，若有100‐400bp扩增子检测出，该引物即为有效引物；利用其近缘属不同野生种材料的DNA进行引物通用性鉴定，若有100‐400bp扩增子检测出，该引物即具有通用性。