[发明专利]一种利用胎盘小叶组织制备亚全能干细胞的方法

摘要

本发明公开了一种从胎盘小叶组织中提取亚全能干细胞的方法，特点是包括胎盘预处理后，利用胎盘小叶组织制备细胞悬液，再利用细胞悬液制备得到亚全能干细胞分离液的步骤；然后将亚全能干细胞分离液进行原代培养和二代培养，收集二代培养过程中完全脱落细胞即得到亚全能干细胞的步骤；最后进行程序降温冻存，将温度降至-80～-90.0℃后取出冻存样本，放入液氮储存罐长期保存即可，优点是传代能力可达20代，不仅具有向成骨、软骨、脂肪和神经细胞分化的能力，还具有向胰岛细胞和表皮细胞分化的能力，亚全能干细胞均一、稳定、生长周期短，操作简单，成本低。

主权项

一种利用胎盘小叶组织制备亚全能干细胞的方法，其特征在于包括以下步骤：  （1）亚全能干细胞分离   A.细胞悬液制备：将胎盘预处理后获取胎盘小叶组织，将胎盘小叶组织剪成0.5～1.5mm3小块，置于无菌离心管内并加入生理盐水混匀后，加入与胎盘组织等体积的浓度为1～1.5mg/ml的Ⅱ型胶原蛋白酶充分混匀，于37℃消化0.5～2小时后，吸取离心管内上清液，将原离心管内的沉淀用生理盐水混匀，瞬间离心并吸取上清液，重复离心操作两次，合并上述各上清液并用200目无菌滤网过滤，收集细胞初悬液；将细胞初悬液于1000～2000rpm的转速下离心5～20分钟，取离心得到的沉淀加入生理盐水定容，得到的细胞悬液；B.亚全能干细胞分离液的制备：将细胞悬液按体积比1～2:1的比例缓慢加入到淋巴细胞分离液中，于500～1000rpm离心5～20min后，离心管内混合液自下到上依次分层为红细胞层、淋巴细胞分离液层、单个核细胞层和生理盐水层，吸取单个核细胞层至另一离心管内，加入1.5倍细胞悬液体积的生理盐水混匀，于1000～2000rpm离心5～20分钟后，将离心所得的沉淀用0.5倍细胞悬液体积的含10%胎牛血清的培养液混匀沉淀，得到亚全能干细胞分离液；   （2）亚全能干细胞培养    将亚全能干细胞分离液以2×105～10×105个/cm2的密度接种到无菌培养瓶内，并加入培养液，然后置于37℃、饱和湿度、CO2体积分数为5% 的培养箱内开始原代培养3‑4天后；将无菌培养瓶内培养液和未贴壁的细胞倒掉，并重新加入相同体积的培养液，置于上述培养箱内继续培养直至无菌培养瓶内细胞达到75～85%的融合度后，倒掉无菌培养瓶内培养液；将浓度为0.25%的胰蛋白酶溶液按20%培养液体积的添加量加入到无菌培养瓶内，37℃消化1～5分钟后，将无菌培养液倒入无菌培养瓶内终止消化，拍打晃动培养瓶，使细胞完全脱落，将完全脱落的细胞和培养液倒入离心管内，于1000～2000rpm离心5～10分钟，将离心所得的沉淀用含10%胎牛血清的培养液混匀沉淀；重复上述步骤进行二代培养，收集二代培养过程中完全脱落细胞即得到亚全能干细胞；      （3）亚全能干细胞冻存    将含10%胎牛血清的培养液和 99% 二甲基亚砜按体积比3:1的比例缓慢混匀后配置成冻存液，放入冰水混合物中预冷15～20min，将预冷过的冻存液慢加入到含有亚全能干细胞的冻存管中，将冻存管放入程控降温仪进行预冷，开始冻存程序，将温度降至‑80～‑90.0℃后取出冻存样本，放入液氮储存罐长期保存。