[发明专利]一种治疗风湿性关节炎的胶原蛋白制备方法

摘要

本发明公开了一种治疗风湿性关节炎的胶原蛋白制备方法，其步骤包括：一、除杂；二、提取；三、分离；四、纯化；五、脱盐干燥，收集沉淀重新溶解，装入透析袋中，对水透析过夜，最后冷冻干燥，获得纯化Ⅱ型胶原蛋白。通过本方法制备了高纯度的能用于治疗风湿性关节炎的胶原蛋白，蛋白质含量≥94％，平均分子量400-800道尔顿，且制备方法简便，利于规模生产。

主权项

一种治疗风湿性关节炎的胶原蛋白制备方法，其特征在于，制备步骤如下：一、除杂：取定量新鲜动物软骨，剥去骨膜，置于液氮下冷冻，再磨成粉末，将软骨粉末置于容器中，加入其质量15倍体积的盐酸胍‑Tris‑HCl缓冲液，于4 ℃下搅拌处理16h，盐酸胍‑Tris‑HCl缓冲液中盐酸肌的浓度为6mol/L , Tris浓度为0.1mmol/L, pH值为7.5 ；二、提取：处理完成后用冷冻离心机离心30min，转速设置8000r/min，收集沉淀，用0.6mmol/L乙酸充分洗涤，然后加入其质量5倍体积的0.6mmol/L乙酸，内含1.5g/L胃蛋白酶悬浮，于4℃下搅拌水解36h ；三、分离：水解完成后，以12000r/min离心处理30min，收集上层清液，用2mmol/L 的NaCl盐析24h，离心，收集沉淀用0.2mmol/L乙酸溶解后装入透析袋，用缓冲液进行透析溶解，缓冲液浓度及组成为 0.1mmol/L Tris‑HCl‑0.4mmol/L NaCl ，pH=7.4，此透析溶解液即为粗Ⅱ型胶原蛋白；四、纯化：将大孔离子交换树脂NKA‑9经0.1mmol/L Tris‑HCl和0.4mmol/L NaCl ，pH=7.4平衡后，装入交换柱内，控制树脂柱径高比≥5，缓缓加入经平衡液透析后的粗Ⅱ型胶原蛋白，调节过柱流速为每小时3～4倍树脂体积，用核酸蛋白检测仪于280nm监测流出液的第一个吸收峰，收集有吸收峰的流出液；五、脱盐干燥：向流出液中加入2mmol/L NaCl 溶液，盐析Ⅱ型胶原蛋白，于4℃下沉淀10‑12h，用冷冻离心机离心20min，转速设置8000r/min，收集沉淀用0.6mmol/L乙酸重新溶解，装入透析袋中，对水透析过夜，最后冷冻干燥，获得纯化Ⅱ型胶原蛋白。