[发明专利]一种microRNA的二次循环扩增检测方法及试剂盒

摘要

本发明提供一种miRNAs的二次方循环扩增检测方法及诊断试剂盒，本发明检测方法只需要一步操作就可以完成二次循环扩增反应，高灵敏度，可以检测到15ul反应体系中的9条RNA链。设计简单，不需要涉及纳米材料的合成和修饰等。噪声很低，从而也增加了灵敏度，特异性和通用性。与传统的Northern印迹分析，微点阵分析方法相比，所需要的样品量很少，特异性很好。与实时定量PCR相比，该方法是恒温反应，使得实验在普通的荧光仪上就可以实现，扩大了方法的使用范围，而且序列的设计简便。该方法可以检测出单个乳腺癌细胞水平的miRNA。本我们可以利用此技术设计肿瘤诊断试剂盒和设备。

主权项

1.一种miRNAs的二次方循环扩增检测方法，包括以下步骤：步骤一：37℃条件下的标准曲线：取5-8个1.5ml的离心管，分别加入分子信标探针、8个碱基的引物、dNTPs、Bst聚合酶、Nb.BbvCI切刻内切酶、lambda核酸外切酶、BSA、RRI，另外设计5-8个浓度梯度(10fM-100nM)的miRNA样品分别加入到以上离心管中37℃恒温孵育2h；所述的分子信标探针的核苷酸序列为：其5′端的两个碱基有硫代标记，3′端标记有淬灭基团DABCYL，另外还含有Nb.BbvCI切刻酶的切刻位点GCTGAGG(下划线)；靠近5′端第10个碱基处标记有荧光基团FAM；所述的8个碱基的引物的核苷酸序列为：其5′端的两个碱基也是硫代标记。步骤二：荧光仪上进行检测，即可得到不同浓度的miRNA样品对应的荧光强度，荧光仪的设置参数如下：激发和发射狭峰宽度均为5nm，电压PMT 700v，激发波长为490nm，发射波长扫描范围500～600nm，根据荧光强度和miRNA样品浓度可得37℃条件下的检测标准曲线；步骤三：改变步骤一中的反应条件为4℃恒温孵育50h，其它条件不变，可得4℃条件下的检测标准曲线；步骤四：对于乳腺癌细胞的检测，首先利用mirVana^TM试剂盒提取出细胞中的miRNA，作为待检测的样品，利用步骤一中的条件可以得到乳腺癌细胞的检测标准曲线；步骤五：将分子信标探针、8个碱基的引物、dNTPs、Bst聚合酶、Nb.BbvCI切刻内切酶、lambda核酸外切酶、BSA、RRI、以及待测样品加入到1.5ml的EP离心管中恒温孵育2h，在荧光仪上进行检测，荧光仪的参数设置与步骤二中荧光仪的参数设置相同，得到的荧光强度和检测标准曲线相对应即可得到样品中含有的miRNA的浓度。