[发明专利]胚源性神经干细胞原代细胞的分离及传代培养方法

摘要

本发明提供一种胚源性神经干细胞原代细胞分离及传代培养方法，其包括以下步骤：原代神经干细胞的分离和培养，传代培养及单细胞克隆、传代，克隆诱导分化，以及间接免疫荧光检测。本发明采用无血清培养和单细胞克隆技术从胚龄12周的新鲜人胚皮层中分离和培养出具有自我更新和多分化潜能的一株神经干细胞，在3周后可形成大量神经干细胞，该细胞具有连续克隆能力，可传达培养，表达神经巢蛋白抗原；分化后的细胞表达神经元细胞、胶质细胞和少突胶质细胞的特异性抗原，解决了胚源性神经干细胞较难培养的问题。

主权项

一种胚源性神经干细胞原代细胞分离及传代培养方法，其特征在于，其采用无血清培养和单细胞克隆技术从人胚大脑皮层中分离和培养出具有自我更新和多分化潜能的神经干细胞，其包括以下步骤：原代细胞的分离和培养，传代培养及单细胞克隆、传代，克隆诱导分化，以及间接免疫荧光检测；其中，所述原代细胞的分离和培养步骤包括：将胚胎在无菌条件下分离出胎脑大脑皮层，剥离硬膜及表面血管，在DMEM/F12的细胞培养液中漂洗，用细吸管吹打瓶内组织碎块至完全散开，制成细胞悬液，经100目不锈钢网过滤，制成单细胞悬液；经分胎蓝染色计数活细胞，加入含B27和EGF、bFGF的DMEM/F12无血清培养基，台盼蓝染色计数活细胞，调整活细胞浓度为1×105/ml，将原代细胞种植于培养瓶，37℃，5％CO2条件下静置培养；所述传代培养及单细胞克隆、传代步骤包括：将原代培养7天后的细胞克隆悬液用吸管轻柔吹打进行机械分离，制成单细胞悬液，用含B27和bFGF的无血清培养液将细胞悬液按1×104ml‑1浓度传代接种于培养瓶，在37℃，5％CO2条件下静置培养7天，同时进行克隆形成实验，计数每代的克隆形成率，每7‑9天机械分离传代，方法同前；采用有限稀释法将原代克隆细胞制成的单细胞悬液，稀释到40ml‑1，于96孔培养板中滴加稀释的细胞悬液，选取仅有一个细胞的培养孔作记号，并动态观察；待长成单细胞克隆球后机械分离成单细胞悬液，再将一个克隆的所有细胞种至培养瓶中，待次代克隆长成后连续传代，最后得到大量来自某单个细胞的亚克隆；所述克隆诱导分化步骤包括：分别选取部分传代及单细胞克隆的细胞种植于多个多聚赖氨酸包被的玻片上，并加入含血清培养基，观察其生长分化情况，分别于7天、14天行免疫荧光检测；所述间接免疫荧光检测步骤包括：将克隆细胞滴至多聚赖氨酸包被的玻片上，贴壁12小时后用4％多聚甲醛固定，进行Nestin抗体免疫荧光染色；分别将传代及单细胞克隆的细胞种植于预置多聚赖氨酸包被玻片的含血清培养集中，于7天、14天时取出，进行Nestin、NeuN、GFAP、CNP抗体的免疫荧光单标染色及NeuN和CNP抗体的免疫荧光双 标染色。