[发明专利]一种肿瘤抑制剂的激酶酶谱筛选方法

摘要

本发明涉及C12Q包含酶或微生物的测定或检验领域，具体为一种肿瘤抑制剂的激酶酶谱筛选方法；它包括下述部分及步骤：步骤一、激酶浓度的确定及优化；步骤二、激酶ATPKm的测定；步骤三、阳性抑制剂星型孢菌素或其他化合物IC50的测定；本发明采用上述步骤，其优点在于可一次对66种激酶进行检测，其检测规模大、速度快，并且灵敏度高。

主权项

 一种肿瘤抑制剂的激酶酶谱筛选方法，其特征是：它包括下述步骤：步骤1、激酶浓度的确定及优化；步骤1.1、确定激酶梯度稀释的最高浓度，将其进行两倍的梯度稀释，得到若干个不同浓度梯度的激酶体系；步骤1.2、将激酶配成一定浓度的溶液，在微孔板中加入缓冲液，并进行两倍的梯度稀释；步骤1.3、将微孔板里已经稀释好的酶转入检测板，离心，室温放置以达到最高活性；步骤1.4、配置0%磷酸化多肽以及100%磷酸化作为对照；步骤1.5、将ATP和多肽的混合溶液转入微孔板中，离心，封膜，振荡，室温反应；步骤1.6、配置激酶反应转化试剂溶液；加样并离心，封膜，振荡，室温反应；步骤1.7、在荧光检测器上读数并记录；步骤1.8、处理并分析实验数据，选取磷酸化率在20%‑40%之间的激酶的浓度，生成激酶浓度——磷酸化率曲线；步骤2、激酶ATP Km 的测定；步骤2.1、根据激酶梯度稀释的结果，确定酶浓度进行ATP Km实验；步骤2.2、配置激酶混合溶液，加入微孔板；步骤2.3、将ATP进行梯度稀释；步骤2.4、将微孔板中的ATP转入检测板，离心，振荡，室温孵育；步骤2.5、配置激酶反应转化试剂，转入检测板，离心，封膜，振荡，室温孵育；步骤2.6、在荧光检测器上读数并记录； 步骤3、阳性抑制剂星型孢菌素或其他化合物IC50 的测定；步骤3.1、根据激酶梯度稀释和 ATP Km 实验结果，确定IC50实验反应条件；步骤3.2、确定待测化合物最高浓度，用有机溶剂进行梯度稀释；步骤3.3、待溶液平衡一定时间后，从微孔板中转移溶液到检测板中，进行离心；步骤3.4、配置激酶多肽的混合溶液，并转移至检测板，离心，静置一定时间；步骤3.5、配置ATP溶液，用自动分液器加样，离心，封膜，振荡，室温孵育；步骤3.6、 配置激酶反应转化试剂，加样，离心, 封膜，振荡，室温孵育后读数；步骤3.7、在荧光检测器上读数并记录。