[发明专利]氧化石墨烯定向固定化葡萄糖氧化酶的工艺方法

摘要

本发明为一种固定化葡萄糖氧化酶的工艺方法，其步骤是：1）将氧化石墨烯溶于蒸馏水中，超声混合得到浓度为1mg/mL的氧化石墨烯悬浊液；向该悬浊液中加入N-羟基硫代琥珀酰亚胺和1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳化二胺，振摇后，洗涤，分离，得酯化氧化石墨烯；2）向均匀的酯化氧化石墨烯悬浊液中加入已活化的伴刀豆蛋白A，反应后离心，充分洗涤沉淀；然后加入葡萄糖氧化酶溶液，反应后充分洗涤，真空冷冻干燥24h即得定向固定化葡萄糖氧化酶。本发明制备固定化酶的方法，固定化效率高，避免了酶活性位点取向不一致或酶活性位点被掩盖等缺点，从而提高了固定化酶的活性；对酶活性损失小，酶活可达150~195U/mg。

主权项

一种固定化葡萄糖氧化酶的工艺方法，其特征包括以下步骤：1）氧化石墨烯的酯化：将氧化石墨烯溶于蒸馏水中，超声混合得到分散均匀的浓度为1 mg/mL的氧化石墨烯悬浊液；向该悬浊液中加入N‑羟基硫代琥珀酰亚胺和1‑乙基‑3‑(3‑二甲基氨丙基)碳化二胺，其配比为在每50 μL 1 mg/mL氧化石墨烯悬浊液中加入100 μg N‑羟基硫代琥珀酰亚胺和44.1 μg 1‑乙基‑3‑(3‑二甲基氨丙基)碳化二胺，然后用2‑（N‑吗啉代）乙磺酸缓冲液(0.1 M, pH 6.0)定容使1‑乙基‑3‑(3‑二甲基氨丙基)碳化二胺终浓度为20 mM，振摇30 min后，高速离心，弃去上清液，在沉淀中加入0.05 M 2‑（N‑吗啉代）乙磺酸缓冲液(pH 6.0)洗涤，离心分离，最后沉淀在真空干燥24 h即得酯化氧化石墨烯；2）定向固定化酶的制备：取上步得到的酯化氧化石墨烯重新悬浮于蒸馏水中，超声分散得到分散均匀的1 mg/mL酯化氧化石墨烯悬浊液，在悬浊液中加入已活化的伴刀豆蛋白A溶液（pH 7.0），其配比为在50 μL酯化氧化石墨烯溶液中加入300~1500μL 0.1 mg/mL伴刀豆蛋白A，反应60 min后，4 oC高速离心，弃去上清液，沉淀用0.05 M 2‑（N‑吗啉代）乙磺酸缓冲液 (pH 6.0)充分洗涤；在沉淀中加入pH 4.5~8.0的葡萄糖氧化酶溶液（0.5 mg/mL），其配比为质量比伴刀豆蛋白A：葡萄糖氧化酶＝1:5，反应30~120 min，4 oC高速离心，弃去上清液，沉淀用磷酸盐缓冲溶液(PBS)充分洗涤后，真空冷冻干燥24 h即得定向固定化葡萄糖氧化酶。