[发明专利]一种蝇类肠道微生物总DNA的提取方法

摘要

一种蝇类肠道微生物总DNA的提取方法，涉及分子生物学实验技术领域。酚氯仿方法是提取细菌DNA的传统方法，但该方法一般用于实验室纯培养细菌的DNA提取。而环境样本由于基质成份和微生物种类都比较复杂，用酚氯仿方法和试剂盒方法提取总DNA，存在细胞裂解率低、DNA损失严重等缺陷，而且提取物中残留的酶抑制物会影响后续PCR扩增和酶反应效果。对此，本发明在样品前处理、操作步骤、试剂溶液等方面进行了改进；本发明采用STE缓冲液对样品进行前处理；使用溶菌酶使革兰氏阳性球菌充分裂解。本发明提取的蝇类肠道微生物总DNA，用于PCR扩增和16SrRNA文库构建，效果优于国产和进口试剂盒。其操作步骤简单，有效降低了操作过程对样品的污染和对DNA分子的破坏。

主权项

一种蝇类肠道微生物总DNA的提取方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）在一个灭菌的3cm培养皿中加入1mLSTE缓冲液，取出蝇类的中肠，在STE缓冲液中悬浮，去除多余的组织，用镊子将中肠夹碎；（2）将由上述步骤（1）获得的中肠悬浮液转移到一个无菌1.5mL离心管中，涡旋震荡1min，200rmp离心2min，将获得的上层液体转移到一个新的无菌1.5mL第二离心管中；（3）再在原有的无菌1.5mL离心管的沉淀中加入0.5mLSTE缓冲液，2～3次重复步骤（2），并将离心后获得的上层液体合并；（4）将上述步骤（3）中合并的上层液体置于无菌1.5mL第三离心管，5000～8000rpm离心2min，直至形成致密的沉淀，吸取并丢弃上层液体，用200µLSTE缓冲液将第三离心管底的沉淀重悬；（5）将上述步骤（4）中获得的沉淀液中加入溶菌酶，使沉淀液中的酶浓度达到4mg/mL，充分混匀，于37℃温度培育1hr；（6）再加入20µL 10%的SDS和1µL 50mg/mL蛋白酶K，充分混匀，55℃温度培育18～24hr；（7）再加入2.5µL 10mg/mL RNA酶A，充分混匀，37℃温度培育1h；（8）再加入等体积的的配比比例为24:1的氯仿:异戊醇(24:1)，充分混匀，12000rmp离心5min；将上清液转入一个新的第四离心管中；（9）将上述步骤（8）中获得的上清液加入等体积的配比比例为25:24:1的酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，充分抽提，12000rmp离心5min，获取上清液转入新的第五离心管中；（10）将上述步骤（9）中获得的上清液加入0.6倍体积的异丙醇，颠倒混合直到白色纤维状DNA沉淀形成；12000rmp离心5min，丢弃上清液，加入70%乙醇离心洗涤2次；（11）将上述步骤（10）中获得的沉淀物，在室温下充分干燥后，用50µL的TE缓冲液溶解沉淀物，获得DNA分子；其中，上述提取方法中，所述STE缓冲液由10 mmol/L Tris‑HCl（pH 8.0），1 mmol/L EDTA，150 mmol/L NaCl 组成；TE缓冲液由10 mmol/L Tris‑HCl (pH 8.0)，1 mmol/L EDTA （pH 8.0）组成。