[发明专利]一种人外周血免疫细胞库的构建方法

摘要

本发明公开了一种人外周血免疫细胞库的构建方法，步骤包括：采集人外周血，分离自体血浆，分离外周血单个核细胞，由外周血单个核细胞分离单核细胞并冻存，由外周血单个核细胞分离T淋巴细胞并冻存，由外周血单个核细胞分离B淋巴细胞并冻存，由外周血单个核细胞分离NK细胞并冻存，编码入库。本发明把健康或青年人的免疫细胞分离出，并分别单独冻存，关联编号保存入库，使保存的人免疫细胞具有活性高、纯度高、使用方便的特点，并且用人自体血浆可以代替胎牛血清使用，避免了引入外源蛋白。同时本发明方法具有成本低、实验室条件要求不高，应用广的优势。

主权项

一种人外周血免疫细胞库的构建方法，步骤包括：采集人外周血，分离自体血浆，分离外周血单个核细胞，由外周血单个核细胞分离单核细胞并冻存，由外周血单个核细胞分离T淋巴细胞并冻存，由外周血单个核细胞分离B淋巴细胞并冻存，由外周血单个核细胞分离NK细胞并冻存，编码入库；其特征在于：所述人外周血采集前，供体应查体符合献血标准；所述分离自体血浆的方法是：将采集的外周血转到离心管中，以1000‑2500转/分钟离心5～15分钟，取上清液得到自体血浆，56℃灭活30分钟后，置‑20℃冻存，备用；所述分离外周血单个核细胞的方法是：将上述去除自体血浆后的沉淀物按体积量计用生理盐水或PBS稀释1倍，再加入其0.5～2倍体积量的1wt%～6wt%的羟乙基淀粉溶液，混匀后静置10～40分钟，分离出上清，并将上清液加入到等体积量的淋巴细胞分离液液面上，2000～5000转/分离心10～30分钟，离心后管内分三层，取中间层细胞即得到外周血单个核细胞；所述分离单核细胞并冻存的方法是：将得到的外周血单个核细胞按照0.1～10×107/ml的密度悬浮在组分为10 wt%FBS+90 wt%1640的培养基中，并按照30ml/瓶的量分装在灭菌的150cm2细胞培养瓶中，静置1h～5h，然后吸取上清液，备用；剩余贴壁细胞即为单核细胞，用生理盐水或PBS将贴壁的单核细胞吹打下来，800～1500转/分离心5～10分钟后，以1～10×105的密度进行分装并液氮冻存，冻存液配方为10 wt%DMSO+6wt%羟乙基淀粉+84 wt%自体血浆；所述分离T淋巴细胞的方法是：采用免疫磁珠法对分离单核细胞收集的上清液进行T淋巴细胞分选，免疫磁珠法采用正分选法，抗体选用CD3抗体，分离出T淋巴细胞后800～1500转/分离心5～10分钟，再以0.1～10×107的密度进行分装并液氮冻存，冻存液配方为10 wt%DMSO+6 wt%甲基纤维素400CP+84 wt%自体血浆；所述分离B淋巴细胞的方法是：继续用分离T淋巴细胞的方法对分离单核细胞收集的上清液进行B淋巴细胞分选，同样采用正分选法，抗体采用CD19或CD20,分离出B淋巴细胞后800～1500转/分离心5～10分钟，再以0.1～10×107的密度进行分装并液氮冻存，冻存液配方为10 wt%DMSO+6 wt%右旋糖酐40+84 wt%自体血浆；所述分离NK细胞的方法是：继免疫磁珠法分离T和B淋巴细胞后，剩余的细胞即为NK细胞，将所述细胞800～1500转/分离心5～10分钟后，以0.1～10×106的密度进行分装并液氮冻存，冻存液配方为10 wt%DMSO+6 wt%海藻糖+84 wt%自体血浆；所述编码入库的方法是：对分离并冻存的各种细胞按照每人一组系统编号，并将个人信息包括编号和保存位置信息统一输入计算机，用于管理与检索。